GA3浸種對露蕊烏頭種子破眠及萌發生理特性的影響

馬文靜， 趙 穎， 魏小紅， 曹 麗

(甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

露蕊烏頭(Aconitumgymnandrum)是毛茛科烏頭屬露蕊烏頭亞屬的唯一物種[1]，海拔2 000 m以上的高山地區均有分布，尤其是在棄耕地或退化草地中經常有較大居群[2]。一方面露蕊烏頭具有重要的藥用價值，露蕊烏頭與川烏、草烏等名貴中藥材親緣關系接近，其葉、花和根皆可入藥，具祛風鎮靜、驅蟲殺蛆的功效，也可用于治療關節疼痛、風濕等病癥[3]。另一方面露蕊烏頭的花顏色鮮艷，也具有一定的觀賞價值。但多年來對露蕊烏頭系統的研究和開發利用一直很少，因此研究露蕊烏頭具有重要的現實意義。

在種子休眠和萌發過程中，激素占據重要的位置，他們能通過信號傳導對種子內各種生理變化做出反應，調節一系列蛋白質、酶的代謝，從而調控種子的休眠和萌發[4]。赤霉素(gibberellin acid, GA3)能顯著促進種子的萌發，GA3在促進種子萌發中至少起到兩種作用：一是軟化種胚周圍的組織，克服種皮機械限制；二是促進種胚的生長[5-6]。研究發現GA3能顯著提高白背紫斑杜鵑和三花杜鵑的發芽率(germination percentage, GP)，發芽勢( germination energy, GE)以及發芽指數(germination index, GI)[7]，GA3能夠促進流動沙丘先鋒植物沙米種子的萌發[8]。此外，王立輝等人研究船盔烏頭種子萌發的適宜溫度為15℃～25℃，最適溫度為25℃[9]。用200、600、1 000 mg·L-1的GA3浸種處理12 h可使短尾越橘的發芽率分別提高到60%、65%和64%[10]。用100、250、500 mg·L-1的GA3浸種處理可極顯著提高烏飯樹種子的發芽率，發芽勢及活力指數(vigor index, VI)[11]。綜上所述，本研究細化GA3濃度設置：0、125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1GA3，設置了18℃(12 h)、25℃(12 h)變溫培養，探究不同濃度 GA3浸種處理對露蕊烏頭種子萌發的影響。

種子萌發是植物建苗的關鍵階段。露蕊烏頭種子的萌發率極低，嚴重限制了露蕊烏頭的開發利用[12]。目前外源GA3已廣泛應用于促進種子萌發，但是使用外源GA3促進露蕊烏頭種子萌發方面的研究尚未見報道。本試驗通過外源GA3處理露蕊烏頭種子對萌發期的碳水化合物含量、水解酶及抗氧化酶活性動態變化進行研究，探討露蕊烏頭種子萌發的最佳培養條件及GA3濃度，明晰外源GA3促進露蕊烏頭種子萌發的生理機制，旨在為破除露蕊烏頭種子休眠及其人工栽培提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料為露蕊烏頭種子，采于海拔2 960～2 970 m的甘肅省天祝草原(東經102°84′， 北緯37°24′)。在露蕊烏頭的植株上直接采集，后將種子風干，人工去掉果殼，在低溫、干燥的環境下保存，備用。

本試驗挑選大小一致、飽滿的露蕊烏頭種子，先用5%的次氯酸鈉溶液消毒滅菌5～10 min，然后用蒸餾水沖洗3～5次。將露蕊烏頭種子在0、125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1GA3溶液中浸泡24 h，然后置于墊有兩層濾紙的培養皿中(φ=9 cm)，每皿放置100粒，每個處理重復6次。將所有培養皿分別置于A：光照強度3 000 Lx，培養溫度25℃(12 h)/18℃(12 h)，B：完全黑暗，培養溫度25℃(12 h)/18℃(12 h)兩個條件下培養[13]，共培養8 d。以種子露白作為萌發標志，每天記錄各皿中發芽的種子數，共統計8 d。試驗結束后計算發芽率，發芽勢，發芽指數和活力指數，分別于第1，3，6天測定相關生理指標。

1.2 測定指標與方法

1.2.1種子發芽指標 發芽率(GP)= 8 d內發芽種子數/供試種子數×100%[14]

發芽勢(GE) = 5 d內發芽的種子粒數/供發芽種子粒數×100%[15-16]

發芽指數(GI)= ∑(Gt/Dt)。其中Gt為8 d的發芽數，Dt為發芽日[17]

活力指數(VI) = 發芽指數×幼苗平均鮮重[18]

1.2.2生理指標測定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定；α-淀粉酶活力采用3,5-二硝基水楊酸法測定；蛋白酶活性采用酪氨酸法測定；脂肪酶活性采用底物乳化法測定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)采用NBT顯色法測定；過氧化物酶(peroxidase, POD)采用愈創木酚氧化法測定；過氧化氫酶(catalase, CAT)采用紫外吸收法測定[19]。

1.3 數據分析

試驗結果數據均重復3次，數據采用Microsoft Excel 2003和SPSS 18.0軟件進行數據分析和圖表繪制，用Duncan進行多重比較分析差異顯著。

2 結果與分析

2.1 光照及黑暗條件下GA3浸種對露蕊烏頭種子萌發的影響

由表1和2可知，在光照和黑暗條件下，在0～1 000 mg·L-1GA3范圍內，隨著GA3濃度的升高，露蕊烏頭種子的發芽率(GP)、發芽勢(GE)、發芽指數(GI)、活力指數(VI)呈現逐漸升高的變化趨勢。當GA3濃度為1 000 mg· L-1時發芽率達到最大值，分別為91.66%和95.67%。與光照相比，黑暗處理下露蕊烏頭種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別提高4.37%，72.19%，26.58%和32.60%。綜上，黑暗條件下1 000 mg·L-1GA3浸種是促進露蕊烏頭種子萌發的最佳條件。

表1 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子在光照條件下萌發率的影響Table 1 Effects of GA3 on seed germinations of Aconitum gymnandrum in illumination

注：同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: The data indicates mean ±SD. Different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level, and different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

表2 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子在黑暗條件下萌發率的影響Table 2 Effects of GA3 on seed germination s of Aconitum gymnandrum in dark

2.2 黑暗條件下1 000 mg·L-1 GA3浸種處理對露蕊烏頭種子萌發中主要物質及相關酶的影響

2.2.1濃度為1 000 mg·L-1GA3浸種處理對露蕊烏頭種子可溶性糖、可溶性蛋白的影響 由圖1可知，萌發第1天，GA3處理與對照種子的可溶性糖含量沒有顯著差異(P<0.05)，與對照相比，萌發第3、6天，GA3處理下種子內可溶性糖含量分別下降11.53%，33.33%。

由圖2可知，與CK處理相比，萌發第1、3天，1 000 mg·L-1GA3處理露蕊烏頭種子內可溶性蛋白含量均無顯著變化(P<0.05)。萌發第6天，1 000 mg·L-1GA3處理的種子的可溶性蛋白含量比對照提高28.30%。1 000 mg·L-1GA3處理與CK處理種子內可溶性蛋白含量均在第6天達到最大值，相比第3天分別提高了78.95%和53.18%。

圖1 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中可溶性糖含量的影響Fig.1 Influences of GA3 on soluble sugar contents in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

圖2 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中可溶性蛋白質含量的影響Fig.2 Influences of GA3 on soluble protein contents in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

2.2.2濃度為1000mg·L-1GA3浸種處理對露蕊烏頭種子α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性的影響 由圖3可知，與CK處理相比，萌發第1、3、6天，1 000 mg·L-1GA3處理下露蕊烏頭種子α-淀粉酶活性分別提高了4.47%、30.56%、7.30%。在萌發過程中，對照組種子內α-淀粉酶活性無顯著變化(P<0.05)，而GA3處理組α-淀粉酶活性在第3天達到最大值，并且在萌發過程中α-淀粉酶活性均保持在較高水平。

圖3 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中α-淀粉酶活性的影響Fig.3 Influences of GA3 on α-amylase activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

如圖4所示，在萌發過程中，用GA3處理的露蕊烏頭種子內蛋白酶活性始終高于CK處理。萌發第1天，與CK相比，1 000 mg·L-1GA3處理種子中蛋白酶活性無顯著變化(P<0.05)。萌發第3、6天，GA3處理露蕊烏頭種子內蛋白酶活性分別比CK提高了48.78%，70%。

圖4 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中蛋白酶活性的影響Fig.4 Influences of GA3 on proteinase activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

如圖5可知，萌發第1天，GA3處理種子中脂肪酶活性比CK下降了10.87%。萌發第3天，經GA3處理的種子脂肪酶活性達到最大值，相比CK提高了48.8%，在處理的第6天，GA3處理種子內的脂肪酶活性比對照提高了17.65%。

圖5 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中脂肪酶活性的影響Fig.5 Influences of GA3 on lipase activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

2.3 黑暗條件下1 000 mg·L-1GA3浸種處理對露蕊烏頭種子萌發中抗氧化酶活性的影響

由圖6所示，隨發芽時間的延長，經1 000 mg·L-1GA3處理的種子SOD活性始終高于CK組。在處理的第1、3、6天，GA3處理的種子內SOD的活性分別比CK提高了6.48%，9.68%，32.67%。

圖6 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中超氧化物歧化酶活性的影響Fig.6 Influences of GA3 on SOD activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

由圖7所示，處理第1天，GA3和CK處理下露蕊烏頭種子內POD活性無顯著性差異(P<0.05)。處理第3、6天，GA3處理下POD活性分別比對照提高了102.80%和24.65%。第6天與第1天相比，經1 000 mg·L-1GA3處理的種子的POD活性顯著提高了160.97%(P<0.05)，CK處理組則提高了119.39%，GA3處理顯著增強露蕊烏頭種子內POD的活性(P<0.05)。

圖7 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中過氧化物酶活性的影響Fig.7 Influences of GA3 on POD activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

由圖8可知，在萌發第1天，經1 000 mg·L-1GA3與蒸餾水(CK)處理的種子CAT活性無顯著差異(P<0.05)。處理第3天，GA3處理露蕊烏頭種子內CAT活性比CK處理提高了30.88%。處理第6天，GA3處理種子內CAT活性比CK處理下降45.57%。

圖8 GA3溶液浸種對露蕊烏頭種子萌發過程中過氧化氫酶活性的影響Fig.8 Influences of GA3 on CAT activity in the process of Aconitum gymnandrum seed germination

3 討論

3.1 外源GA3作用下露蕊烏頭種子的萌發

種子萌發是植物生活史的重要階段，植物種子能對適宜萌發的外界條件做出反應，及時萌發并建苗以避開不利于幼苗生長與存活的惡劣環境，從而提高植物的整體適合度[20]，因此人為設置適宜的外界條件可以有效促進種子的萌發。GA3作為一種信號物質，在促進種子萌發的過程中發揮著重要的作用。周麗霞、李赫男等人對紫花高烏頭和黃花烏頭種子的研究表明不同濃度的GA3處理對烏頭種子萌發的促進效果不同[21-22]。李開祥等研究表明GA3可以促進肉桂種子的萌發[23]。本實驗結果表明，0、125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1不同濃度梯度的GA3處理露蕊烏頭種子后均可以提高種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數，其中以1 000 mg·L-1的GA3處理結果最為明顯。此外，黑暗處理下的露蕊烏頭的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均高于光照處理組。說明黑暗條件下培養，1 000 mg· L-1GA3浸種是促進露蕊烏頭種子的萌發的最佳條件。

3.2 外源GA3作用下對露蕊烏頭種子主要物質及相關酶的影響

種子成熟的過程中會積累大量的可溶性糖、可溶性蛋白等貯藏物質，當種子打破休眠進入萌動狀態時，首先動用胚部或胚中軸的可溶性糖及貯藏蛋白。吳玉香等研究表明GA3使西洋杜鵑中的可溶性糖、可溶性蛋白發生不同的變化[24]。黃珍等人研究表明GA3處理使得華重樓種子可溶性糖呈下降趨勢[25]。胥學峰研究表明用GA3處理黃芪后的可溶性蛋白含量呈先下降后上升的趨勢[26]。本研究表明1 000 mg·L-1GA3處理后的露蕊烏頭種子萌發中可溶性糖和可溶性蛋白的變化情況均比CK處理的種子變化顯著。在萌發過程中，與對照相比，GA3浸種促進了露蕊烏頭種子內可溶性糖的水解，為種子萌發提供動力。1 000 mg·L-1GA3處理露蕊烏頭種子內可溶性蛋白的含量先下降后上升，萌發前期可溶性蛋白水解為其他物質為種子的萌發提供能量；萌發后期可溶性蛋白含量上升這可能與露蕊烏頭種子內相關代謝酶的積累變化有關，因為大多數代謝酶的本質是蛋白質。綜上所述，GA3處理促進了露蕊烏頭種子中可溶性糖的水解和可溶性蛋白的水解再合成，從而為種子打破休眠提供足夠的動力。

種子萌發過程中，貯藏于其組織中的大分子物質在相關代謝酶類(α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等)的催化作用下被分解成可溶性的小分子物質，隨后運送到胚的生長部位被繼續的分解和利用。魚小軍等人研究表明外源GA3提高了條葉車前種子的α-淀粉酶的活性從而促進了種子的萌發[27]。本實驗結論與其基本一致。結果表明GA3提高了α-淀粉酶的活性，α-淀粉酶可以促進了種子內淀粉的水解，淀粉僅作為一種暫時的貯藏物質，不斷的水解為可溶性糖以滿足種子萌發生長所需要的營養物質，萌發第6天，可溶性糖的積累已經足夠并一直處于水解狀態，使得淀粉酶的活性降低。在萌發過程中，GA3處理和CK中蛋白酶活性都降低，但相比對照而言，GA3提高了蛋白酶的活性，可以促進可溶性蛋白水解為氨基酸，水解后的氨基酸可以重新合成其他蛋白質。GA3促進蛋白質的新陳代謝，這和本研究中可溶性蛋白含量的變化相一致。與CK處理相比，GA3處理提高了露蕊烏頭種子內脂肪酶活性，促使種子內部貯藏物質大量分解，然后將營養物質輸送到各器官供生長使用，從而促進露蕊烏頭種子打破休眠狀態繼而進入萌發狀態。

3.3 外源GA3作用下露蕊烏頭種子抗氧化酶活性的變化

4 結論

本文研究表明，在光照和黑暗條件下，適宜濃度的GA3浸種均可以提高露蕊烏頭種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數，其中黑暗條件下培養，1 000 mg·L-1GA3浸種是促進露蕊烏頭種子萌發的最佳條件。 通過測定1 000 mg·L-1GA3浸種處理后種子萌發期生理指標，進一步探索了其萌發機制，發現GA3可以通過改變露蕊烏頭種子內可溶性糖及可溶性蛋白的含量，提高相關水解酶及抗氧化酶的活性來促進種子萌發?？傊诎禇l件下培養，1 000 mg·L-1GA3浸種可用于實際生產中促進露蕊烏頭種子的萌發。