響應面法優化黃芪莖葉總黃酮提取工藝及其抗炎活性研究△

黃文靜，孫曉春，周瑞，張嚴磊，謝培，李鉑，王二歡，唐志書*

(1. 陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712083；2. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710077)

黃芪是豆科黃芪屬植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranceus(Fisch.)Bge.的干燥根，為我國常用大宗藥材[1]。傳統醫學認為，黃芪具有補氣固表，斂瘡生肌，利尿托毒等功效[2-3]，在歸脾丸、降糖丸、參茸白鳳丸、龜鹿補腎丸、補中益氣丸、產復康顆粒等經典組方中均有黃芪，其應用十分廣泛[1]。現代醫學研究認為黃芪有效成分具有強心降壓、保護血管、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖等功能[4]。據報道，黃芪藥材主要活性成分為黃酮類物質，具有顯著的促進細胞增殖和抗氧化等活性[5]。目前已從黃芪藥材中分離出30多種黃酮類物質，包括芒柄花素、毛蕊異黃酮和紅車軸草異黃酮等[6]。

我國內蒙古、山西、甘肅、青海和陜西北部均有種植黃芪的傳統，其產區分布十分廣泛，由于市場對黃芪的需求量逐年增加，種植規模還在不斷擴大[7]。通過前期研究發現，黃芪莖葉中含有大量的黃酮類化合物，但每年藥材采挖后地上莖葉往往丟棄，因此造成巨大的浪費。本研究在前期實驗的基礎上，通過響應面法優化黃芪莖葉總黃酮提取工藝，同時對其進行抗炎活性分析，以期為黃芪莖葉黃酮類物質的開發和深層次利用提供理論依據。

1 材料與儀器

本實驗用黃芪經陜西中醫藥大學王繼濤研究員鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜莢黃芪Astragalusmembranceus(Fisch.)Bge.混交種，其地上部分莖葉于9月上旬采自甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉麻界村黃芪種植基地。將割取的黃芪莖葉置于陰涼處晾干，粉碎機粉碎后裝于塑料袋中避光密封保存。

95%乙醇、無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉和Tris等化學試劑購于陜西樂博生化試劑有限公司，均為分析純；蘆丁標準品購于陜西標普醫藥科技有限公司；96孔細胞培樣板(Corning 公司)，DMEM培養基(Gibco 公司)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)為美國 Sigma 公司產品，Griess 試劑購自北京華奧正生公司，小鼠巨噬細胞系RAW264.7購于中國科學院上海細胞庫。

高速粉碎機(廣州美的)、UV-2600紫外分光光度計(日本島津)、HH-8數顯恒溫水浴鍋(上海一恒)、電子天平(北京賽多利斯)、電熱鼓風干燥箱(上海博訊)、RE-200A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器)、超聲波儀(昆山超聲儀器有限公司)、CO培養箱(賽默飛世爾)、SW-CJ-10潔凈工作臺(蘇州安泰)、Infinite M200 PRO酶標儀。

2 方法

2.1 總黃酮含量測定

總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[8]。以蘆丁作為對照品，于510 nm 處測定不同濃度蘆丁溶液的吸光值，以吸光度值(Y)為縱坐標、蘆丁濃度(X)為橫坐標繪制蘆丁標準曲線，得線性回歸方程為：Y=9.322 9X-0.003 9(r=0.998 8)。

稱取干燥黃芪莖葉粉末20 g，用醇提法進行提取。將醇提物烘干后加入50 mL 無水乙醇溶解，以無水乙醇為空白，取1 mL 醇溶液在510 nm處測定吸光度值，根據蘆丁標準曲線計算總黃酮含量。

樣品提取率(%)=0.0025X×100%

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2.2 總黃酮提取工藝

黃芪莖葉總黃酮提取的工藝流程。樣品粉碎→過40目篩→稱重→加入乙醇→超聲提取30 min→回流提取90 min→抽濾→減壓濃縮→烘箱烘干→提取物浸膏。

2.3 單因素試驗

在固定乙醇體積分數為60%、液料比15∶1、提取溫度為60 ℃、超聲功率為100 W的條件下，分別考察乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)、超聲功率(50、100、150、200、250 W)對黃芪莖葉總黃酮得率的影響。

2.4 黃芪莖葉總黃酮提取工藝優化

在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法進行提取工藝條件的優化[9-10]。選取乙醇濃度、液料比、提取溫度、超聲功率4個因素為自變量，以總黃酮得率為響應值，進行四因素三水平實驗設計，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面分析因素與水平

2.5 黃芪莖葉總黃酮體外抗炎性評價

黃芪莖葉總黃酮體外毒性試驗采用MTT法，以提取物處理下巨噬細胞RAW264.7的細胞存活率表示毒性大小。按照趙燦等[11]的方法，采用經典的Griess 試劑來檢測亞硝酸鹽，從而測定出總NO 濃度。取對數生長期的巨噬細胞RAW264.7，以地塞米松為對照藥品使用LPS誘導其產生NO，于酶標儀上測定550 nm處吸光值，根據標準曲線求出各處理NO濃度，計算NO抑制率[12]。

(2)

2.6 數據處理

各指標測定的數據用Excel處理作圖，采用Design-Expert 8.0軟件處理得響應面分析結果。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 乙醇濃度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 如圖1所示，隨著乙醇濃度的增加黃芪莖葉總黃酮得率逐漸增高，當乙醇濃度大于70%時黃酮得率保持在3.3%左右，遠高于50%和60%乙醇濃度下的總黃酮得率，乙醇濃度為90%時總黃酮得率最高為3.49%。

圖1 乙醇濃度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.1.2 液料比對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 如圖2所示，黃芪莖葉總黃酮得率隨著乙醇用量的增加呈先增高后降低的趨勢，液料比為15∶1時黃酮得率最大為2.96%，而液料比30∶1時總黃酮得率僅為2.35%，由此可見高乙醇用量并不能使總黃酮得率增加，從降低成本考慮后續試驗選擇液料比為15∶1最為適宜。

圖2 液料比對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.1.3 溫度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 由圖3可知，當提取溫度在60～70 ℃之間時總黃酮得率最高，較低溫度下(50 ℃)總黃酮的得率僅為2.78%，溫度過高(>80 ℃)也不利于總黃酮的提取，這有可能是黃酮在高溫下的性質不穩定所致。

圖3 溫度對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.1.4 超聲功率對黃芪莖葉總黃酮得率的影響 由圖4可知，在所試驗的超聲功率范圍內，總黃酮得率與超聲功率呈正相關關系，超聲功率越大黃酮得率越高，超聲功率50W時總黃酮得率僅為2.26%，而超聲功率200W時總黃酮得率高達3.35%。

圖4 超聲功率對黃芪莖葉總黃酮得率的影響

3.2 黃芪莖葉總黃酮提取工藝條件的優化

根據單因素試驗的結果，按表1所示的因素和水平采用響應面法設計進行后續試驗。

3.2.1 回歸模型的建立與檢驗 采用Design-Expert 8.0軟件處理表2數據，進行多元回歸擬合后得到總黃酮得率(Y)與乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)和超聲功率(D)的回歸方程：Y=8.65-0.11A+0.34B+0.26C-0.28D+0.15BA-0.05AC-0.17AD+0.81BC+ 0.12BD+0.085CD-1.64A2-1.84B2-1.33C2-2.80D2。該方程中各一次項系數的絕對值和正負值分別代表該因素對響應值影響的大小和方向，各因素按影響大小排序依次為B>D>C>A，液料比對黃酮得率影響最大，乙醇濃度的影響最小。該方程的二次項系數為負值，推斷方程響應面的開口向下，具有極值點，對該方程進行方差分析結果見表3。

表2 響應面分析方案和試驗結果

表3 回歸模型方差分析

3.2.2 響應面交互分析 通過固定四個因素其中的兩個因素為零水平，可繪制響應面和等高線，直觀地考察其他兩因素的交互效應對總黃酮得率的影響[13-14]。在所得響應面圖中，曲面越陡峭，則該因素對總黃酮得率的影響越顯著；等高線圖與響應面圖相對應，等高線圖形狀越接近橢圓形，表明兩個因素間的交互作用越強[15]。由圖5～10可以看出，提取溫度和乙醇濃度的響應曲面較為平緩，表明其交互作用較弱(圖6)；液料比和乙醇濃度、超聲功率和乙醇濃度、提取溫度和液料比、超聲功率和液料比、超聲功率和提取溫度的響應曲面(圖5、圖7～10)均較為陡峭，表明這些因素之間的交互作用較強；圖7、圖9和10圖的等高線圖最接近于橢圓形，說明超聲功率和乙醇濃度、液料比以及提取溫度之間的交互作用最強。由此可見，在黃芪莖葉總黃酮的提取過程中，除提取溫度和乙醇濃度之外，不同因素之間的相互影響較強，對總黃酮的得率存在著一定的協同作用，其中尤其要考慮到超聲功率的影響。

3.2.3 最佳條件優化及驗證 通過對3.2.1所得的回歸方程分析，所得黃芪莖葉總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度79.71%，液料比15.59∶1，提取溫度71.32 ℃，超聲功率197.77 W，在此工藝條件下所得的總黃酮的理論值為8.69%。為驗證此條件的準確性，本著節約成本和試驗操作的便利，將上述條件修正為乙醇濃度80%、液料比15∶1、溫度70 ℃、超聲功率200 W，在此條件下，重復實驗3次，總黃酮得率為8.58%，表明該優化后的工藝參數能很好地提取黃芪莖葉總黃酮。

圖5 液料比和乙醇濃度響應曲面

圖6 提取溫度和乙醇濃度響應曲面

圖7 超聲功率和乙醇濃度響應曲面

圖8 提取溫度和液料比響應曲面

圖9 超聲功率和液料比響應曲面

圖10 超聲功率和提取溫度響應曲面

3.3 黃芪莖葉總黃酮的抗炎活性

3.3.1 細胞毒性 采用MTT法測定了黃芪莖葉總黃酮對RAW264.7細胞存活率的影響，如圖11所示，總黃酮濃度在1～50 μg·mL-1范圍內對RAW264.7細胞存活率的影響無顯著差異，說明在此濃度范圍內黃芪莖葉總黃酮對細胞無毒性。當總黃酮濃度達100 μg·mL-1時細胞存活率顯著下降，說明在此高濃度下，總黃酮對細胞產生毒害。

注：*.代表與對照組差異顯著( P<0.05)。圖11 不同濃度總黃酮處理對細胞存活率的影響

3.3.2 抗炎活性 如圖12所示，正常狀態下RAW264.7細胞的NO釋放量在5 μmol·L-1左右，加入黃芪莖葉總黃酮后，NO的釋放受到明顯抑制。總黃酮濃度在1～50 μg·mL-1時，NO釋放量與對照組差異達極顯著水平；隨著黃酮添加濃度的增加，NO的釋放量不斷升高，當處理濃度為100 μg·mL-1時，NO釋放量升高至4.52 μmol·L-1，這可能是高濃度的總黃酮產生了一定的細胞毒性所致。

注：**. 代表與對照組差異極顯著( P<0.01)；*.代表與對照組差異顯著( P<0.05)。圖12 不同濃度總黃酮處理對NO釋放量的影響

如圖13所示，LPS能夠極顯著的誘導RAW264.7細胞NO增加，LSP處理后NO的釋放量由4.89 μmol·L-1上升至21.89 μmol·L-1，增加約4倍。黃芪莖葉總黃酮的加入除能夠降低細胞本底NO水平外(圖12)，還顯著地抑制了由LPS所引起的NO釋放量的增加，隨著總黃酮濃度的增加細胞NO濃度不斷降低，存在明顯的劑量效應。在LPS誘導下向RAW264.7細胞加入100 μg·mL-1總黃酮和加入對照藥品20 μg·mL-1地塞米松所產生的NO釋放量差異不顯著，說明黃芪莖葉總黃酮有較為明顯的抗炎活性。

圖13 LPS誘導與不同處理對NO釋放量的影響

4 結論與討論

本研究通過響應面法分析得到黃芪莖葉總黃酮提取的最佳工藝：乙醇濃度80%，液料比15∶1，提取溫度70 ℃，超聲功率200 W，在此技術參數下總黃酮得率為8.58%。超聲功率與乙醇濃度、液料比和提取溫度等因素之間的交互影響很強，與前期未經超聲波處理的黃芪莖葉相比(另文發表)，經過超聲處理后的黃芪莖葉通過醇提，其總黃酮的含量上升一倍左右，因此在實際生產中應當重視超聲處理的作用。本研究所得的實驗模型具有較好的預測性，實驗重復性好，可為黃芪莖葉總黃酮的工業化提取提供一定的理論支持。

NO是一種常見的炎性介質，過量的NO可導致一系列炎癥疾病的發生[16]。本研究發現，一定濃度范圍內的黃芪莖葉總黃酮(1～50 μg·mL-1)對RAW264.7細胞無明顯毒性，除能夠減少RAW264.7細胞本底NO的生成外，還可有效抑制由LPS所誘導的NO濃度急劇上升，由此說明，黃芪莖葉總黃酮具有一定的抗炎活性。