七氟醚對新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用

黃劍峰，冼海燕，侯小瓊

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)麻醉科，南寧 530000； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，南寧 530021)

七氟醚因起效迅速，可控性好，氣道刺激性小等優(yōu)點(diǎn)，是目前兒科麻醉中應(yīng)用最為廣泛的吸入麻醉藥。最近的研究表明常用的吸入全麻藥暴露對中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有不同程度的毒害作用，嬰幼兒大腦從孕中期開始至出生后的幾年處于發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，容易受到外界不良因素的影響。研究表明長時(shí)間暴露于七氟醚會誘導(dǎo)發(fā)育期動物大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，導(dǎo)致遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙[1-4]。神經(jīng)干細(xì)胞都具備分化成為神經(jīng)元等神經(jīng)系統(tǒng)各種不同細(xì)胞的潛能。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞主要分布于腦室/腦室下區(qū)(ventricular/subventricular zone，VZ/SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層等部位，并且神經(jīng)發(fā)生從發(fā)育期一直持續(xù)到成年[5]。目前大量研究主要集中在七氟醚對神經(jīng)元的損傷作用和機(jī)制，但對神經(jīng)元的前體神經(jīng)干細(xì)胞的影響研究較少，本研究擬從神經(jīng)干細(xì)胞增殖角度探討七氟醚中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的發(fā)生及防治機(jī)制，為全麻藥物神經(jīng)毒性的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)選用初生7 d雄性SD大鼠48只，清潔級，體重15 ～ 20 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK (桂) 2016-0054]。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動物管理委員會批準(zhǔn)(2016-0113)，在實(shí)驗(yàn)動物中心屏障動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK (桂) 2016-0037]，實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(美國Baxter Healthcare公司)，BSA封閉液、顯影定影試劑盒、TBST緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)，Nestin、Cyclin D1、Smad4、BMP2單克隆抗體(美國Abcam公司)，β-actin、FITC綠色熒光二抗及DyLight 594紅色熒光二抗(北京中杉金橋生物生物技術(shù)有限公司)，兔多抗BrdU(美國Accurate Chemical)。切片機(jī)(德國Leica CM1900)，熒光顯微顯微鏡(日本Olympus BX61)，病理圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型制備及分組

將動物隨機(jī)分為3組，每組16只，即對照組(Con組)、1%七氟醚組(S1組)、3%七氟醚組(S2組)。在麻醉氣體揮發(fā)罐中加入適量液態(tài)七氟醚，將氧氣罐的輸出端連接至小動物麻醉機(jī)的入口處，麻醉機(jī)出口接至麻醉誘導(dǎo)箱中，溫度控制在(37±2)℃。將動物放入麻醉誘導(dǎo)箱中，開通氣閥，使氧氣罐中的氧氣攜帶揮發(fā)罐中的七氟醚進(jìn)入麻醉誘導(dǎo)箱中，從而使動物麻醉。調(diào)整七氟醚的濃度，2 L/min流量，麻醉持續(xù)4 h。麻醉終止后6 h，處死大鼠，于冰上迅速離出大腦，切取額葉內(nèi)含腦室區(qū)(VZ)和腦室下區(qū)(SVZ)的腦組織。

1.3.2 Nestin/BrdU雙標(biāo)檢測神經(jīng)干細(xì)胞增殖

采用免疫熒光染色法，鼠腦冷凍好后，將其在切片機(jī)內(nèi)固定好，切片厚度20 μm，將貼好的腦片放于片盒內(nèi)保存在-20℃內(nèi)。腦片在TBS溶液中進(jìn)行水化，放置于室溫下15 min，吸干腦片周圍的水分，加入鼠單抗Nestin(1∶200)和兔抗鼠BrdU(1∶200)混合，4℃過夜；棄掉一抗，PBS洗5 min。FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶200)和DyLight 594紅色的熒光二抗(1∶400)加到載玻片的組織上，室溫孵育2 h，PBS清洗，用濾紙吸干組織周圍水分，滴加一滴稀甘油，蓋片。將制備好的玻片放置在熒光微鏡400倍下觀察，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，雙標(biāo)Nestin/BrdU陽性細(xì)胞數(shù)與Nestin陽性細(xì)胞數(shù)目比值為神經(jīng)干細(xì)胞增殖率(%)。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)

蛋白裂解液處理各組樣品，使用超聲破碎儀低溫裂解3次，每次30 s，離心(4℃，12 000 r/min，10 min)，取上清測定蛋白濃度，配平各組蛋白濃度，蛋白變性，經(jīng)SDS-PAGE分離電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，Nestin(1∶500)、Cyclin D1(1∶1000)、Smad4(1∶1000)、BMP2(1∶500)4℃冰箱過夜，棄掉一抗，TBST洗膜5 min，3次；將膜轉(zhuǎn)入雜交袋，室溫孵育二抗(1∶10 000)2 h，棄掉二抗，TBST洗膜5 min，3次；ECL系統(tǒng)顯影，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值之比表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 七氟醚麻醉對Nestin蛋白表達(dá)的影響

Nestin蛋白表達(dá)，S1組(0.54±0.04)和S2組(0.43±0.06)均低于對照組(0.61±0.06)，其中S2組中Nestin蛋白表達(dá)與對照組相比差異有顯著性(P< 0.05)。結(jié)果見圖1。

圖1 七氟醚麻醉對新生鼠腦組織Nestin蛋白表達(dá)影響(n=6)Figure 1 Effects of sevoflurane anesthesia on protein expression of Nestin in the brain of neonatal rats

2.2 七氟醚麻醉降低的新生鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖

對照組中Nestin/BrdU雙陽性細(xì)胞數(shù)目所占Nestin陽性細(xì)胞百分比為(41.3±6.7)%，S1組和S2組雙陽性細(xì)胞百分比分別為(25.6±7.2)%和(17.4±5.9)%。與對照組比較，S1組和S2組神經(jīng)干細(xì)胞增殖率降低，差異均有顯著性(P< 0.05)，結(jié)果見圖2。

表1 七氟醚麻醉對新生鼠腦組織中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表達(dá)影響Table 1 Effects of sevoflurane on protein expression of Cyclin D1, Smad4, and BMP2 in brain tissue of neonatal rats

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：標(biāo)尺=50 μm。圖2 七氟醚對新生鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響(n=6)Note. Bars=50 μm.Figure 2 Effects of sevoflurane on the proliferation of neonatal rat neural stem cells

2.3 七氟醚麻醉影響新生鼠腦組織中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表達(dá)

與對照組比較，S1組和S2組細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的表達(dá)下調(diào)(P< 0.05)。與對照組比較，S1組和S2組Smad4和BMP2表達(dá)增高，差異均有顯著性(P< 0.05)，結(jié)果見圖3和表1。

圖3 七氟醚對新生鼠腦組織中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表達(dá)影響(n=6)Figure 3 Effects of sevoflurane on protein expression of Cyclin D1, Smad4, and BMP2 in brain tissue of neonatal rats

3 討論

七氟醚作為臨床廣泛使用的吸入麻醉藥，對未成熟神經(jīng)系統(tǒng)的損傷已引起廣泛關(guān)注。已研究表明七氟醚麻醉出生7 d小鼠6 h，引起海馬和前額皮質(zhì)等多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元調(diào)亡[6]。神經(jīng)元是由神經(jīng)干細(xì)胞分化而來，七氟醚麻醉對神經(jīng)干細(xì)胞是否有不良作用，目前尚不清楚。胚胎時(shí)期許多部位都存在神經(jīng)干細(xì)胞，終生存于VZ/SVZ區(qū)、海馬齒狀回、大腦皮層等部位。其高度自我更新能力，維持自身數(shù)目的穩(wěn)定和干細(xì)胞的特性。Nestin作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物，有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞增殖，分化成熟作用，隨著神經(jīng)干細(xì)胞完成遷移和分化，Nestin表達(dá)逐漸減少甚至消失。通過Western blot檢測不同組別Nestin表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，七氟醚處理后，Nestin表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢，說明內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量是減少的。

大腦發(fā)育處于未成熟階段，容易受外界不良因素影響神經(jīng)干自我更新、增殖和分化能力。如果干細(xì)胞在本該保留增殖能力的階段脫離了細(xì)胞周期，就會沒有足夠的神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生新的神經(jīng)元維持神經(jīng)發(fā)育的后期階段，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生的異常[7]。BrdU常用于標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的DNA，隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞中，判斷細(xì)胞的增殖能力。BrdU與Nesin雙標(biāo)檢測神經(jīng)干細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn)，S1組和S2組VZ區(qū)和SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖率低于對照組，這與以往的研究類似[8]。以上結(jié)果說明，七氟醚對新生鼠神經(jīng)干自我更新的能力具有干預(yù)作用。研究中發(fā)現(xiàn)，對照組的Nestin陽性細(xì)胞主要集中在VZ區(qū)和緊鄰該區(qū)的SVZ區(qū)，S1組Nestin陽性細(xì)胞減少主要是在VZ區(qū)，在SVZ區(qū)并無明顯減少，且Nestin陽性細(xì)胞還有向SVZ區(qū)遠(yuǎn)端擴(kuò)展趨勢；S2組Nestin陽性細(xì)胞減少也主要是在VZ區(qū)，以及鄰近VZ區(qū)的SVZ區(qū)，SVZ區(qū)遠(yuǎn)端仍保持較高的Nestin陽性細(xì)胞。目前仍不清楚為何出現(xiàn)此現(xiàn)象，尚需進(jìn)一步研究。

Cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，Cyclin D1基因敲除，抑制了在體海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)和SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞走向凋亡[9-10]。Cyclin D1基因過表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[11]。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，S1組、S2組腦組織中Cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，提示七氟醚誘發(fā)增殖抑制的機(jī)制與下調(diào)腦組織Cyclin D1有關(guān)。

BMP2屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成員，其信號通路參與神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的作用[12]。BMP2及其受體發(fā)揮作用主要通過Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)[13-14]。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，細(xì)胞外的BMP2與細(xì)胞膜表面的BMPRⅠ、BMPRⅡ結(jié)合形成復(fù)合物，BMPRⅡ磷酸化后，再激活BMPRⅠ而形成活化的復(fù)合物，然后引起Smad磷酸化而激活，活化的Smad發(fā)生構(gòu)象改變，從受體上游離，與細(xì)胞質(zhì)中的Smad1/4結(jié)合，共同轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)錄Cyclin D1，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡[12,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中七氟醚處理后，BMP2和Smad4表達(dá)增強(qiáng)，而Cyclin D1表達(dá)降低，神經(jīng)干細(xì)胞增殖率降低。已有報(bào)道全麻藥物可抑制發(fā)育期大腦神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元的増殖，神經(jīng)細(xì)胞增殖減少可影響認(rèn)知功能[16]，與本研究結(jié)果相似，推測此七氟醚可能影響了神經(jīng)細(xì)胞的增殖。

綜上所述，七氟醚麻醉新生大鼠導(dǎo)致VZ/SVZ區(qū)Nestin表達(dá)下降，干細(xì)胞增殖活性降低，該變化和腦內(nèi)Cyclin D1信號下調(diào)、BMP2和Smad4水平上調(diào)有關(guān)。