CD44相關亞型在裸鼠原位胃癌生長轉移中的表達變化及機制

周 洲，高采平，邱春華，王 晗，李良平

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院消化內科，成都 610072)

胃癌是實體腫瘤中最為常見的一種[1]。影響胃癌治療效果和死亡的主要原因是轉移。臨床上，很多胃癌患者在行根治性手術前已出現微轉移，為術后轉移和復發的直接原因。探討與胃癌轉移相關的因素，闡明其轉移機制，控制轉移，尋找預防和治療的有效途徑，是當前研究的重要方向。CD44是由20個外顯子編碼，通過選擇性剪接而產生CD44標準體(CD44s)和CD44變異體(CD44v)[2]。CD44s由CD44外顯子1～5及16～20組成。而CD44變異體分為CD44v1～v10，分別由對應的外顯子6～15編碼而成，這些外顯子可以通過選擇性剪接單個的或多個的和CD44的標準體組合進而可能產生數千種不同的CD44亞型，每種CD44亞型可能作用不同，因此，CD44結構和功能都很復雜[3]。CD44標準體和亞型都與腫瘤轉移密切相關，特別是CD44v3、CD44v6、CD44v9。為了解在胃癌轉移過程中，CD44s及各亞型的表達水平、表達變化，用兩種胃癌細胞構建原位胃癌模型，在腫瘤轉移過程中，采用循環腫瘤細胞(CTC)實時監測CD44各亞型表達水平及變化過程，并采用免疫組織化學及Western blot了解原位胃癌中CD44各亞型表達水平，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 SGC-7901、MNK-45胃癌細胞均購自中國科學院上海細胞庫。4～6周齡BALB/c-nude雌性裸鼠，體質量18～20 g，購自中國科學院上海斯萊克實驗動物中心。免疫組織化學SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。CD44s引物、CD44v3引物，CD44v6引物，CD44v9引物由上海生工公司合成。CTC細胞提取磁珠CELLectionTMEpithelial Enrich購自Life Technologies公司，單細胞mRNA反轉錄試劑盒Single cell-to-Ct購自Ambion公司，qPCR試劑盒SsoAdvanced SYBR綠色熒光超級混合液購自Biorad公司。CD44v3、CD44v6、CD44v9單克隆抗體及二抗均購自Abcam公司。

1．2方法

1.2.1細胞培養 SGC-7901、MNK-45胃癌細胞均在含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2裸鼠原位瘤模型的構建 取處于對數生長期的細胞制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×108/mL。用注射器在每只裸鼠右側肩胛部皮下注射細胞懸液0.1 mL，注射后輕壓5 s。每組2只裸鼠。將裸鼠重新放回籠中觀察，右側肩胛部皮下出現米粒大小質硬結節為模型建立成功。2周后，以頸椎脫臼法處死，小心剝取移植瘤，在培養液中分割成1 mm×1 mm的組織碎塊。接下來建立原位胃癌移植模型，每組10只。用濃度為2.5%異氟烷誘導麻醉，待裸鼠鎮痛后，用手術剪在裸鼠左上腹部做一約1 cm的橫切口，暴露腹腔組織，小心分離將胃暴露出腹腔，用生物膠將1塊胃癌組織粘在裸鼠胃組織上。然后用6.0不可吸收外科縫線關閉腹腔。整個操作過程在超凈工作臺中完成。之后每天觀察裸鼠狀態，測量裸鼠體質量。8周后，當裸鼠出現惡病質(表現為消瘦，腹水及精神萎靡)，處死所有裸鼠，剖腹觀察并統計原發腫瘤大小，轉移灶位置及個數，同時對原發腫瘤進行稱質量。分離轉移瘤及原發灶，放入10%甲醛中固定，用于免疫組織化學檢測。另取部分原發灶腫瘤組織保存于液氮罐中，用于RT-PCR及Western blot的檢測。

1.2.3收集裸鼠眼眶血采集CTC 于造模后第2、3、4周從裸鼠眼眶靜脈叢采血。左手拇指及食指輕輕壓迫動物的頸部兩側，使眶后靜脈叢充血。右手持續接7號針頭的1 mL注射器由眼內角刺入，針頭斜面先向眼球，刺入后再轉180°使斜面對著眼眶后界。當感到有阻力時即停止推進，同時，將針退出約0.1～0.5 mm，邊退邊抽。每次采血量每只約0.2～0.3 mL。通過免疫磁珠富集法(試劑盒：CELLectionTMEpithelial Enrich)收集裸鼠CTC富集液，將篩選的細胞液在顯微平臺下進行形態學篩選，共篩選了3個循環腫瘤組織。篩選標準：(1) 細胞呈圓形、橢圓形或長形，長徑大于10 μm；(2)光鏡下可見完整細胞形態及細胞核；(3)核漿比失常。將選定的CTC在單細胞挑取臺上細針挑取收集，以備單細胞RT-qPCR分析。

1.2.4RT-qPCR檢測CD44 mRNA水平表達的變化 收集后的CTC行單細胞RT-qPCR，檢測CTC CD44各亞型(CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9)表達差異。Single cell-to-Ct試劑盒提取3個細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA，并以CD44各亞型及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)對應引物進行預擴增。預擴增后產物2 μL加入25 μL含對應引物的SsoAdvanced SYBR 綠色熒光超級混合液進行qPCR，采用SYBR綠色熒光標記法檢測PCR產物。檢測各基因表達水平，以GAPDH為內參照。RT-qPCR結果采用儀器自帶軟件分析，根據標準曲線計算基因拷貝數。記錄各實驗組熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數即Ct值，以GAPDH為內參，計算目的mRNA的相對表達量(2-ΔΔCt)。所有引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物的設計根據GenBank的基因序列、用Primer5.0軟件設計，引物序列見表1。

1.2.5免疫組織化學檢測CD44各亞型蛋白的表達 分離得到的腫瘤組織包埋、固定、石蠟切片、脫蠟，3%H2O2室溫孵育30 min，熱修復抗原，滴加正常山羊封閉液封閉，加入一抗兔抗人CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9單克隆抗體，濕盒4 ℃中過夜，次日加入二抗鼠抗兔抗體，濕盒中37 ℃、30 min、DAB顯色，常規乙醇梯度脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并記錄。陽性反應為細胞質內出現棕黃色顆粒。

1.2.6Western blot檢測CD44各亞型蛋白的表達 提取原位胃癌組織的總蛋白并定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，調節電壓，分離膠120 V，基層膠60 V，以染料的前沿遷移至凝膠的底部為標準終止電泳。恒定電流70 mA轉膜1 h。5%脫脂奶粉封閉膜，一抗孵育4 ℃搖床過夜，加二抗37 ℃孵育1 h，增強化學發光法顯色，顯影定影，沖洗膠片，對條帶進行灰度分析。

表1 RT-qPCR引物模板

2 結 果

2.1裸鼠一般生存情況分析 SGC-7901組細胞及MNK-45組細胞均成功構建皮下移植瘤，小心剝取移植瘤，在培養液中分割成1 mm×1 mm的組織碎塊，分別建立原位胃癌移植模型，每組10只。兩組裸鼠均成功構建原位胃癌模型，見圖1。SGC7901組在觀察第2周1只裸鼠發生死亡，在第4周有2只裸鼠發生死亡，其余裸鼠均順利采集CTC。MNK-45組在第2周有2只裸鼠發生死亡，第3、4周分別有1只裸鼠發生死亡，其余裸鼠均順利采集CTC。

A：裸鼠皮下移植瘤;B:剝取移植瘤;C:構建原位胃癌模型。

圖1裸鼠造模情況

2.2CTC計數變化 于造模后第1、2、3、4周從裸鼠眼眶靜脈叢采血。通過免疫磁珠富集法收集裸鼠CTC富集液，將篩選的細胞液在顯微平臺下進行形態學篩選，篩選標準如前所述，計數CTC，兩組原位胃癌CTC細胞數隨時間延長遞增，見圖2。

圖2 裸鼠CTC計數水平

2.3CD44各亞型表達水平差異 采用RT-qPCR檢測CTC細胞中CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9表達水平變化。在SGC-7901組，隨著時間進展，各組基因表達量逐漸升高，不同時間組之間差異有統計學意義(F=461.547，P=0.000)，CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9均如此，時間和各組基因表達量存在交互效應，差異有統計學意義(F=10.386，P=0.000)。在MNK-45組，研究結果與SGC-7901組相似，隨著時間進展，各組基因表達量逐漸升高，不同時間組之間差異有統計學意義(F=537.642，P=0.000)，CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9均如此，時間和各組基因表達量存在交互效應，差異有統計學意義(F=16.122，P=0.000)。SGC-7901組和MNK-45組CD44v9表達水平在各時間均明顯高于CD44s、CD44v3、CD44v6，見表2。

2.4免疫組織化學及Western blot了解CD44各亞型表達差異 將兩組裸鼠處死后，分離原位胃癌組織，采用免疫組織化學檢測CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9在原位胃癌中的表達水平。在兩組細胞構建的原位胃癌中，CD44v9表達水平最高，細胞質中可見明顯棕黃色顆粒，呈強陽性，且主要集中在細胞膜，明顯高于CD44s、CD44v3，CD44v6表達水平。Western blot結果，在SGC-7901組中，CD44v9蛋白表達水平明顯高于CD44s、CD44v3，CD44v6組(F=13.486，P<0.05)。在MNK-45組，CD44v9蛋白表達水平也明顯高于CD44s、CD44v3、CD44v6組(F=10.578，P<0.05)，見圖4。

表2 各CD44亞型隨時間表達差異

A：SGC-7901 CD44s表達水平(免疫組織化學×200)；B：SGC- 7901 CD44v3表達水平(免疫組織化學×200)；C：SGC- 7901 CD44v6表達水平(免疫組織化學×200)；D：SGC-7901 CD44v9表達水平(免疫組織化學×200)；E：MNK-45 CD44s表達水平(免疫組織化學×200)；F：MNK-45 CD44v3表達水平(免疫組織化學×200)；G：MNK-45 CD44v6表達水平(免疫組織化學×200)；H：MNK-45 CD44v9表達水平(免疫組織化學×200)；I、J：Western blot檢測胃癌中蛋白質的表達量

圖4 CD44各亞型表達差異

3 討 論

在我國胃癌是一種發病率高、惡性程度高、預后不良的惡性腫瘤。長期以來,臨床手術切除及輔助性放療、化療技術的應用并沒有帶來滿意的生存率[4]。

CD44是黏附分子家族成員，在胃癌轉移中有重要作用。SAKAKURA等[5]通過對一系列胃癌細胞系的研究，及多種與胃癌干細胞相關的表面分子標記物的篩選，提出CD44具有作為胃癌干細胞表面分子標記物的可能。CD44的結構和功能非常復雜，目前研究多集中在CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9。在卵巢癌中，研究發現CD44v6的表達在復發性腫瘤比原發性要高，尤其在腹腔的轉移癌，CD44v6的表達和臨床病理參數及腫瘤進展相關，干擾CD44v6則降低了腫瘤細胞的黏附及遷移能力[6]。在結直腸癌中，也有研究發現CD44v6的表達和間質表型及較差的預后相關[7]。CD44v9在結腸癌的腫瘤干細胞發揮重要作用，影響結腸癌的腫瘤侵襲、轉移，并且CD44v9在一些腫瘤中被作為腫瘤干細胞的分子標記物[8]。在胃癌中，HIRATA等[9]研究了88例胃癌標本發現，CD44v9在復發性的胃癌中高表達，認為CD44v9是監測胃癌復發的有效指標。MIMA等[10]在肝癌中研究發現CD44s能通過調節TGF-β介導的間質表型進而影響肝癌細胞的侵襲、轉移和預后，并認為CD44s的高表達是肝癌潛在的治療靶點。但是，并非所有的研究都支持CD44的高表達與腫瘤轉移相關。在前列腺癌中，LAZARI等[11]在研究了135例前列腺癌患者標本發現，CD44s的低表達和前列腺癌的侵襲能力相關；在舌癌中，也有發現CD44s的低表達與舌癌腫瘤細胞的侵襲能力相關，并認為它是臨床相關的預后指標[12]。

盡管CD44在很多細胞的進程，包括細胞增殖、分化、運動等方面發揮重要作用，關于CD44變異體和標準體在腫瘤中發揮的作用卻眾說紛紜，觀點不一，各個研究報道也不一致甚至互相矛盾。CD44v與CD44s可能發揮完全不同的作用，若將CD44作為一個整體研究時，可能造成遺漏轉移過程中的重要基因轉型，妨礙對腫瘤轉移機制的研究。因此，在研究CD44時，不能將CD44作為單一的整體分子而要具體細分進行研究。實際上，到目前為止，尚少見系統性的在胃癌轉移過程中研究CD44各亞型動態變化的報道。

本研究采用兩種胃癌細胞系構建原位胃癌模型，收集在原位胃癌生長過程中CTC，動態監測CD44s、CD44v3、CD44v6、CD44v9在胃癌生長轉移過程中的表達變化。結果表明，CD44v9在兩種胃癌細胞的造模模型中均隨時間表現出明顯升高，明顯高于CD44s、CD44v3、CD44v6的表達水平，差異有統計學意義。并且進一步原位胃癌免疫組織化學及Western blot也表明，CD44v9表達水平在原位胃癌中最高，和HIRAGA等[12]研究結果一致。表明在胃癌轉移模型中，CD44v9表達水平隨時間推移均高于其他CD44亞型，可能在腫瘤轉移中起主導作用。

CD44與胃癌轉移是目前研究的熱點，靶向CD44可能成為治療胃癌的新途徑。但既往研究將CD44作為一個整體，靜態地在腫瘤組織中研究CD44表型具有很大局限性。本研究表明CD44v9在胃癌生長及轉移過程中起主導作用，為胃癌的轉移機制及靶向治療奠定基礎。