食管癌中MicroRNA-149與DNA聚合酶β的靶向關系

張 滿，李 敏，趙國強

鄭州大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室 鄭州 450001

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長18～24個核苷酸的小型非編碼單鏈RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區(3’UTR)特異性結合，可在轉錄和翻譯水平調節基因的表達，進而發揮生物學效應[1]。研究[2-3]顯示miRNA在癌癥發生、發展過程中起重要作用，部分發揮癌基因的作用，而部分發揮抑癌基因的作用。DNA聚合酶β(DNA polymerase，polβ)是DNA聚合酶家族的主要成員，參與DNA堿基切除修復(base excision repair，BER)[4-6]，其表達與一些惡性腫瘤的發生、發展及預后關系密切[7-9]。我們通過生物信息學分析發現polβ 3’UTR存在miRNA(miR)-149結合位點，但miR-149在食管癌中對polβ是否存在調節作用，尚不清楚。為此，本研究擬對64例食管癌標本中miR-149和polβ的表達水平進行檢測，并利用雙熒光素酶報告實驗和Western blot實驗探討食管癌EC9706細胞中polβ與miR-149的靶向關系。

1 材料與方法

1.1主要材料食管癌細胞EC9706購自上海中科院細胞庫。質粒pmirGLO、雙熒光素酶測定試劑盒均購自 Promega公司。Trizol試劑、LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測試劑盒購自Stratagene公司。胎牛血清、RPMI 1640培養基、反轉錄試劑盒均購自Thermo公司。BCA蛋白測定試劑盒購自Beyotime公司。抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司。化學發光檢測試劑盒購自Amersham Pharmacia Biotech公司。miR-149 mimics和miR-149 scramble購自GenePharma公司。

1.2食管癌和癌旁正常組織中miR-149和polβmRNA的檢測收集2014年到2015年在鄭州大學第一附屬醫院和林州市腫瘤醫院收治的食管癌患者手術切除的癌組織及其相應的癌旁正常組織標本，共64對。本研究由鄭州大學倫理委員會批準。使用Trizol試劑從組織標本中提取總RNA，反轉錄得cDNA。根據 miR-149 堿基序列設計特定反轉錄引物，polβ引物為通用引物。反轉錄條件為：16 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，16 ℃終止。然后以cDNA為模板進行PCR。根據試劑盒說明書配制PCR體系。PCR反應條件：預變性94 ℃ 3min；94 ℃ 20 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 20 s，40個循環；94 ℃ 3 min,16 ℃終止。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。U6 snRNA為miR-149的內參，β-actin為polβ的內參。miR-149和polβ mRNA表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.3miR-149靶基因的生物信息學預測利用TargetScan和miRanda軟件，分析預測miR-149與polβ的可能結合位點。

1.4轉染miR-149的EC9706細胞中polβ蛋白的檢測將EC9706細胞均勻鋪于6孔板，用含有體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，在37 ℃和體積分數5%CO2條件下培養過夜，待細胞長至融合度達70%～80%時用于實驗。實驗分為3組：空白對照組、miR-149組和陰性對照組，每組3個復孔。空白對照組只加入LipofectamineTM2000，miR-149組利用LipofectamineTM2000轉染miR-149 mimics，陰性對照組利用LipofectamineTM2000轉染miR-149 scramble。轉染前換新鮮的DMEM培養液，轉染后繼續培養6 h，棄去原細胞培養液，加入新鮮的含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養48 h。然后分別收集3組細胞，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將提取的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉移到PVDF膜上，封閉，4 ℃下加一抗多克隆兔抗人polβ(稀釋度11 000)孵育過夜，洗滌，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(稀釋度13 000)孵育2 h。以β-actin作為內參，使用化學發光檢測試劑盒在成像系統(美國ProteinSimple公司，FC-M型)下觀察，并進行定量分析。

1.5雙熒光素酶報告實驗①野生型(Wt)polβ 3’UTR雙熒光素酶報告質粒的構建：以人類基因組DNA為模板，PCR擴增含有miR-149推定結合位點的人Wt-polβ 3’UTR片段，將Wt-polβ 3’UTR克隆到pmirGLO報告載體中，將重組 pmirGLO質粒轉化到大腸桿菌感受態DH5α中培養，隨機挑取陽性菌落進行PCR鑒定，經測序證實得到重組質粒pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR。②使用BTX ECM 2001電穿孔儀，將miR-149 mimic和pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR、miR-149 scramble和pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR共轉染EC9706細胞，培養24 h后，用雙熒光素酶測定試劑盒測定熒光素酶活性。實驗重復3次。雙熒光素酶活性檢測使用的儀器是德國 Berthold 公司的多功能微孔板測讀儀(Centro XS③LB 960)。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0進行統計學分析。對食管癌和癌旁正常組織中miR-149和polβ mRNA表達水平進行Pearson相關分析；3組細胞中polβ蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t法檢驗，對雙熒光素酶報告實驗結果進行兩獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1食管癌組織中polβmRNA和miR-149的表達情況qRT-PCR結果顯示，以癌旁正常組織表達水平為1，癌組織中polβ mRNA表達水平為(2.8±0.4)，miR-149表達水平為(0.4±0.1)。Pearson相關分析顯示：癌組織中polβ mRNA和miR-149表達水平呈負相關(r=-0.671，P<0.001)。

2.2生物信息學預測結果結果(圖1)顯示，polβ的3’UTR區和miR-149存在結合位點。

圖1 miR-149在polβ 3’UTR區的預測結合位點

2.3轉染miR-149的EC9706細胞中polβ蛋白的表達空白對照組、陰性對照組和miR-149組polβ蛋白表達水平分別為(1.207±0.143)、(1.038±0.117)和(0.541±0.062)，3組比較差異有統計學意義(F=28.461，P<0.001),miR-149組polβ蛋白表達水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，提示上調miR-149表達可抑制EC9706細胞中polβ蛋白的表達。

2.4雙熒光素酶報告實驗結果重組質粒pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR的測序結果顯示，插入的片段與預期完全一致(圖2)。miR-149 mimic和pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR共轉染組EC9706細胞中熒光素酶活性(0.513±0.022)，miR-149 scramble和pmirGLO-Wt-POLβ 3’UTR共轉染組為(1.090±0.125)，前者較后者降低(t=7.895,P<0.001)，說明polβ是miR-149的靶基因。

圖2 重組質粒pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR測序結果

3 討論

研究[10-13]發現，polβ在結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腦膠質瘤、卵巢癌和胃癌等多種腫瘤組織中存在高表達的現象。Polβ的高表達可引起細胞自身突變率增加，可能參與了腫瘤細胞的損傷修復、增殖，可增強某些腫瘤細胞對放化療的耐受性，導致復發風險提高[14-15]。在食管癌組織中，polβ表達水平高于正常組織，并且影響腫瘤的發生、發展進程[16]。另外，polβ高表達可導致食管癌細胞對化療藥順鉑敏感性降低[15-18]。本實驗結果顯示，食管癌組織中polβ mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織，miR-149表達水平明顯低于癌旁正常組織，且癌組織中polβ mRNA和miR-149表達水平呈負相關。本研究結果提示，食管癌組織中 miR-149的低表達可能是polβ mRNA高表達的原因之一。

miR-149在肝癌、膠質瘤、腎細胞癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達水平均明顯低于正常組織[19-25]。上調肝癌組織中miR-149的表達可抑制癌細胞的遷移和侵襲[20-22]。上調miR-149-5p的表達可抑制腎癌細胞的增殖和遷移，并促進細胞凋亡，表明miR-149-5p可能在腎細胞癌中起著腫瘤抑制劑的作用[23]。在神經膠質瘤組織中miR-149的表達與患者的預后密切相關，提示其具有潛在的臨床意義[24-25]。Warnecke-Eberz等[26]研究發現，食管腺癌中miR-149相對于正常組織低表達。本研究結果顯示，上調食管癌細胞EC9706中miR-149的表達可抑制polβ蛋白的表達，miR-149可通過結合polβ 3’UTR下調polβ的表達。miR-149低表達可能是食管癌發生、發展的重要原因之一。

綜上所述，食管癌中miR-149與polβ存在靶向關系，miR-149可能通過結合polβ 3’UTR下調polβ的表達，從而在食管癌的發生發展中發揮重要作用。