全反式維甲酸對食管癌KYSE70細胞增殖、遷移及Notch1、DLL4、VEGF-C表達的影響

桑露倩，李 娜，王 映，都小晗，路顏娟，路太英

鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,居世界癌癥相關死亡原因的第6位，在中國排名第4位[1-2]。目前食管癌的治療包括手術切除、放療和化療，但其總生存率<10%，5 a生存率仍<25%[3]。復發轉移是導致死亡的主要原因，然而轉移性擴散的分子機制尚不清楚。研究[4-5]表明，惡性腫瘤的侵襲轉移主要與腫瘤新生微血管和淋巴管的形成有關。Notch信號通路在血管發生發展的多個方面起重要調控功能[6]，DLL4-Notch信號通路在調控血管生成、發育過程中扮演著重要角色[7]。血管內皮生長因子-C(VEGF-C)是首先被發現的淋巴管生成因子，通過與血管內皮生長因子受體(VEGFR)3結合，刺激淋巴管內皮細胞的增殖和遷移，促進實體瘤內淋巴管的新生以及腫瘤細胞通過淋巴系統向全身擴散[8-9]。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是一種天然的維生素A衍生物，不僅參與胚胎發育和細胞生長分化，而且與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和血管生成等密切相關，已用于多種腫瘤的治療[10]。這一過程必須依賴于ATRA與其特異性受體相結合。維甲酸受體β(retinoic acid receptor β, RARβ)是最重要的維甲酸類受體，其作為腫瘤抑制基因，在食管鱗癌的發生發展過程發揮重要作用[11]。該研究觀察了ATRA單獨及聯合 RARβ激動劑CD2314或抑制劑LE135對食管癌KYSE70細胞增殖、遷移以及Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表達的影響，探索ATRA抗食管癌微血管和淋巴管生成的可能機制，為食管癌的抗微血管和淋巴管治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料KYSE70細胞由鄭州大學基礎醫學院腫瘤實驗室贈送。RPMI 1640培養基、DMSO為北京索萊寶科技有限公司產品。胎牛血清為杭州四季青公司產品。ATRA(用無水乙醇制成1 mmol/L的儲備液，4 ℃避光保存)、LE135(用無水乙醇制成10 mmol/L的儲備液,-20 ℃保存)均購自Sigma公司，CD2314(用無水乙醇制成10 mmol/L的儲備液,-20 ℃保存)購自Apexbio公司，CCK-8試劑為日本同仁公司產品。兔抗人Notch1、DLL4、β-actin抗體購自美國Abcam公司，兔抗人VEGF-C抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2細胞培養及分組KYSE70細胞單層貼壁生長于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中常規培養。將KYSE70細胞分為4組：ATRA組(ATRA終濃度為10 μmol/L)、ATRA+CD2314組(ATRA終濃度為10 μmol/L、CD2314終濃度為1 μmol/L)、ATRA+LE135組(ATRA終濃度為10 μmol/L、LE135終濃度為1 μmol/L)和對照組(不加藥物處理)。

1.3CCK-8法檢測各組細胞的增殖將KYSE70細胞接種于96孔板，每孔5 000個，過夜培養，待貼壁后，按1.2分組培養，同時設調零孔(只有培養液)，每組設6個平行孔。分別培養24、48、72 h后，CCK-8法測細胞增殖情況。每孔加入CCK-8試劑(5 g/L)10 μL，孵育1～2 h后，選擇450 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定光密度(OD)值。然后按[(OD對照組-OD實驗組)/(OD對照組-OD調零孔)]×100%計算細胞增殖抑制率。實驗重復3次。

1.4劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力KYSE70細胞接種于6孔板中，5×105個/孔，每孔加2 mL含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，培養24 h，用無菌槍頭沿孔板中央劃一條直線，按1.2分組培養，每組設3個平行孔。分別在0、24 h 拍照，用圖像處理軟件測量劃痕寬度，遷移率=(0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度)/0 h的劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

1.5Westernblot檢測各組細胞中Notch1、DLL4及VEGF-C蛋白的表達KYSE70細胞接種于6孔板，過夜培養后，按1.2分組培養48 h，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制體積分數為10%的分離膠和體積分數為5%的濃縮膠，上樣，蛋白電泳、轉膜、封閉，加入兔抗人Notch1、DLL4及VEGF-C 抗體一抗(按11 000稀釋)及β-actin單克隆一抗(按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日取出膜片，于TBST溶液中洗滌3次，每次5 min，分別加入HRP標記的二抗(按12 000稀釋)室溫、水平搖床上孵育1 h，暗室ECL發光液發光、顯影及定影。以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用GraphPad Prism6進行數據分析。采用單因素方差分析比較各組細胞增殖抑制率，遷移率及Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表達的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞增殖能力比較見表1。隨著藥物作用時間的延長，3個藥物組細胞增殖抑制率均逐漸上升；與ATRA組相比，ATRA+CD2314組細胞增殖抑制率升高，ATRA+LE135組細胞增殖抑制率降低。

表1 各組KYSE70細胞的增殖抑制率(n=3) %

#:與ATRA組相比，P<0.05

2.2各組細胞遷移能力的變化各組處理24 h后細胞遷移情況見表2。可知，ATRA組細胞遷移能力低于對照組；ATRA+CD2314組低于ATRA組，而ATRA+LE135組高于ATRA組。

表2 各組細胞遷移率及Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表達的比較(n=3)

*：與對照組相比，P<0.05；#：與ATRA組相比，P<0.05

2.3各組細胞中Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表達的比較見表2、圖1。藥物處理48 h后，ATRA組細胞Notch1蛋白表達量高于對照組，而DLL4和VEGF-C蛋白表達量低于對照組；ATRA+CD2314組細胞Notch1蛋白表達量高于ATRA組，而DLL4和VEGF-C蛋白表達量低于ATRA組；ATRA+LE135組細胞Notch1蛋白表達量低于ATRA組，DLL4和VEGF-C蛋白表達量高于ATRA組。

1：對照組；2：ATRA+LE135組：3：ATRA組；4：ATRA+CD2314組

圖1各組細胞中Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表達的比較

3 討論

微血管和淋巴管的生成是惡性腫瘤侵襲轉移的重要機制之一。血管生成為腫瘤提供氧和營養物質，更為腫瘤的血行轉移提供了條件。研究[6]發現，在血管生成中起重要作用的DLL4-Notch信號通路是有希望的腫瘤治療新靶點之一。Notch信號通路是一種高度保守的信號傳導途徑[6]，與Shh、Wnt、Ras、EGFR、VEGF等信號通路共同調節腫瘤的發生、發展[12]。由于細胞環境的變化，Notch信號通路在腫瘤的調節過程中具有致癌作用或抑癌作用的“雙刃劍”效應[13]。研究[14-16]表明，Notch受體和配體的異常表達以及Notch信號的異常激活與多種惡性腫瘤的發生密切相關；其中Notch1作用顯著，且在腫瘤相關試驗中被廣泛研究。有研究[17]顯示Notch1通路在食管鱗癌中是腫瘤抑制因子。DLL4作為內皮細胞中Notch唯一的特異性配體對于胚胎血管發育和動脈調節的發育十分重要[18]。實驗[19]表明在腫瘤中DLL4的上調與微血管和淋巴管生成密切相關。

VEGF-C是腫瘤血管生成、浸潤和轉移的關鍵因子，具有增強淋巴管生成的特殊功能[20]，與其受體VEGFR3結合后能誘導血管及淋巴管內皮細胞生長，促進腫瘤轉移。研究[21]已證實VEGF-C過表達的食管癌患者預后不良。

ATRA作為目前研究最為深入、作用最強的分化誘導劑，通過誘導腫瘤細胞分化，逆轉腫瘤細胞的生物學特征，已被用于多種腫瘤尤其是急性早幼粒細胞性白血病的治療[22]。已有研究[23-26]表明，ATRA不僅可激活細胞的凋亡信號通路，抑制食管癌細胞的增殖和遷移，而且可降低食管癌細胞VEGF、PI3K、MMP-2等的表達以及VEGF信號轉導途徑中CD31、CD34和CD105的表達，并下調Ang-1、Ang-2、Tie-2、Flt-1和KDR等基因的表達水平，從而影響食管癌細胞中新生血管的生成。

ATRA主要與視黃酸受體結合形成復合物，作用于相應的靶基因，發揮抗腫瘤作用。RARβ是甲狀腺/類固醇受體超家族成員的核轉錄調控因子。據報道[27-28]，RARβ基因的失活與多種實體腫瘤的發生密切相關。我們之前的研究[29]已證明RARβ在正常食管黏膜中的表達高于食管癌組織;在食管鱗癌的發生過程中RARβ丟失明顯，說明RARβ在食管黏膜癌變過程中起重要作用。因此，增加RARβ的表達可能會增強ATRA的抗腫瘤作用，甚至是逆轉腫瘤分化的一個潛在的途徑。

本實驗結果表明：與對照相比，ATRA可抑制食管癌細胞增殖、降低細胞遷移能力，同時增強Notch1蛋白的表達，抑制DLL4和VEGF-C蛋白的表達。相比單藥ATRA，ATRA聯合RARβ激動劑CD2314對食管癌細胞增殖和遷移能力的抑制作用更加顯著；ATRA聯合RARβ抑制劑LE135對食管癌細胞的抑制能力則較單藥ATRA減弱。

綜上所述，ATRA抑制KYSE70細胞增殖和遷移的作用可能是通過上調Notch1蛋白，下調DLL4、VEGF-C蛋白的表達來調節的，增強RARβ的表達可進一步增強這一作用。該研究為探索ATRA抗腫瘤新生微血管和淋巴管的作用機制奠定了一定的理論基礎，為ATRA的臨床應用提供更充分的理論依據。