Bcl-2抑制劑TW37聯用紫杉醇對EC9706細胞增殖和凋亡的影響

劉衛華，秦甜甜，李蕾蕾，張雪燕，霍峻鋒，石曉麗，王 淙

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

食管鱗狀細胞癌是食管癌的主要組織學亞型，主要發生在非洲南部和東部、日本及中國某些地區；晚期疾病患者的5 a生存率低于20%[1]。Bcl-2蛋白家族已經被證實在多種腫瘤組織中的表達發生改變，尤其是Bcl-2、Bcl-xl等[2]。因此，本實驗驗證常規抗癌藥物紫杉醇(PTX)與Bcl-2抑制劑TW37聯用能否有效抑制食管癌EC9706細胞的增殖，為臨床食管癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1細胞及試劑食管癌EC9706細胞株購自中國科學院細胞庫(中國上海)，由鄭州大學藥物研究院保存。RPMI 1640培養基、胰蛋白酶消化液及結晶紫染液(北京索萊寶科技有限公司)，標準胎牛血清(以色列BI公司)，凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，MTT粉(美國BD公司)。

1.2細胞培養EC9706細胞培養于RPMI 1640培養基中，每500 mL培養基補充50 mL胎牛血清。細胞在體積分數為5% CO2、37 ℃環境中培養，隔天傳代或更換培養基，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3MTT法檢測細胞增殖抑制率消化、收集EC9706細胞，用完全培養基稀釋后以每孔4 500個細胞的密度均勻接至96孔板中。細胞過夜后加入PTX、TW37或同時加入2種化合物(濃度均為0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)作為實驗組，另設空白實驗組和陰性對照組。48 h后，每孔加入20 μL MTT(500 mg/L)。反應4 h后吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO后搖床振蕩10 min，酶標儀在570 nm處測定吸光度值。實驗結果用于確定后續實驗濃度。增殖抑制率(%)=(對照孔吸光度值-實驗孔吸光度值)/(對照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。實驗重復3次。

1.4細胞克隆形成率的測定每孔1×103個EC9706細胞均勻接種到6孔板中。細胞過夜后每孔加入0.8 μmol/L PTX、0.8 μmol/L TW37或者同時加入0.8 μmol/L PTX和0.8 μmol/L TW37，持續培養7 d，每3 d更換一次含藥培養基。以不加藥物的細胞作為對照。7 d后每孔加入1 mL甲醇固定30 min。PBS洗去固定液后加入結晶紫染色30 min，純凈水洗至無背景后室溫風干，采用Image J軟件計算細胞克隆形成率。實驗重復6次。

1.5細胞凋亡率的測定EC9706細胞接種到6孔板中，細胞過夜后加入含0.8 μmol/L PTX、0.8 μmol/L TW37或兩者聯合的培養基，加入不含藥物的完全培養基作為對照。24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化、離心并收集細胞，每孔細胞分別加入500 μL 1×Binding Buffer、5 μL Annexin V和PI混勻后避光染色15 min。上流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 20.0進行數據分析。不同組間細胞克隆形成率、細胞凋亡率的比較均采用析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 實驗結果

2.1PTX單用或聯用TW37對EC9706細胞增殖抑制率的影響結果見圖1。可知，隨給藥濃度增加，PTX及TW37聯用對EC9706細胞有明顯的增殖抑制作用。后續實驗采用0.8 μmol/L化合物聯用。

圖1 PTX單用或聯用TW37對EC9706細胞增殖抑制率的影響

2.2PTX單用或聯用TW37對EC9706細胞克隆形成率的影響結果見圖2及表1?？芍琍TX或TW37對細胞的平板克隆形成有一定抑制作用；PTX聯合TW37使用時可以使細胞增殖能力減弱。

A：對照組；B：PTX組；C：TW37組；D：TW37+PTX組

表1 各組EC9706細胞克隆形成率比較%

FPTX=205.244，FTW37=234.365，F交互=375.787,P均<0.001

2.3PTX單用或聯用TW37對EC9706細胞凋亡率的影響結果見表2?？芍?，任一化合物單用或2個化合物聯用均可以使細胞凋亡率增加。

表2 各組EC9706細胞凋亡率比較 %

3 討論

TW37是使用基于結構的設計策略設計的新型非肽小分子抑制劑，靶向Bcl-2中的BH3結合槽，抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1的表達，有研究[3-4]表明TW37對Bcl-2蛋白具有高親和力。Bcl-2蛋白是一種在多種腫瘤組織中表達上調的抗細胞凋亡蛋白，其表達水平與治療耐藥性和預后差密切相關[5-6]。TW37可抑制肺癌H1975細胞生長并且通過抑制AKT信號傳導途徑誘導細胞凋亡[7]。因此作者考慮TW37與PTX聯用，增強PTX療效，以期降低劑量并減少不良反應。

PTX是世界上使用最廣泛的化療藥物之一，PTX通過干擾微管蛋白聚合-解聚過程，進而阻礙腫瘤細胞的有絲分裂，引起細胞周期阻滯，最終導致細胞凋亡，是一類極具前景的抗腫瘤藥物[8]。PTX在臨床上用于治療頭頸部癌、食管癌、胃癌等。有研究[9]表明PTX對免疫細胞，包括效應性T細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等具有廣泛調節作用，PTX殺傷腫瘤細胞的同時可以逆轉腫瘤的免疫逃逸。因此，對于許多類型的癌癥，PTX都是一線化療藥物，包括卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和食管癌等[10]。但是，長期廣泛用藥也存在很多問題，如胃腸道反應、過敏、心臟毒性和耐藥性等。因此，與其他藥物聯用，增強PTX的療效，降低PTX的使用劑量，可以有效減輕不良反應。

在本研究中，作者評估了Bcl-2抑制劑TW37聯合抗癌藥物PTX對食管癌細胞的增殖抑制作用。作者觀察到，TW37和(或)PTX作用于EC9706細胞48 h后，細胞增殖抑制率逐漸升高。另外，2種化合物聯用還能抑制細胞克隆形成，誘導細胞凋亡。因此，TW37聯合PTX可作為食管癌治療的新策略。