α-烯醇化酶在肝癌組織中的表達及臨床意義

朱威威，陳曉龍，陳建安，何玉婷，余 炎，胡秋月，孫冉冉，任志剛，李 娟，崔光瑩，張敏敏，余祖江

鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 450052

原發性肝癌居目前我國常見惡性腫瘤的第四位及腫瘤致死病因的第三位[1-2]，在全世界惡性腫瘤發病率中占第六位[3]。原發性肝癌主要包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和HCC-ICC混合型3種不同病理類型，其中HCC占85%～90%[4]。肝炎病毒、長期酗酒、非酒精性脂肪性肝炎、黃曲霉毒素污染食物等是HCC發生的高危因素。甲胎蛋白是目前應用最廣泛的肝癌腫瘤標志物，多用于術后監測和療效評估，但其敏感性和特異性均不理想[4]。因此，尋找肝癌新的分子標志物，提高肝癌早期確診率，以及尋找肝癌治療的新靶點顯得尤為重要。研究[5]證實葡萄糖攝入增加和有氧糖酵解是腫瘤代謝的特征，針對這些途徑的關鍵酶分析為靶向治療提供了方向。α-烯醇化酶(α-enolase，ENO1)是糖酵解途徑的關鍵酶[6]，在胃癌、腎細胞癌、神經膠質瘤[7-9]等多種腫瘤中高表達，在腫瘤的發生及發展中有重要作用。有研究[10]表明ENO1在肝癌組織中也呈高表達，具有癌基因的作用，但是由于研究中所用樣本量較小，研究結果需要進一步證實。本研究利用TCGA和GEO公共數據庫的大樣本肝癌表達譜數據，聯合組織芯片技術進行分析，從mRNA和蛋白水平驗證ENO1在HCC中的表達及與臨床病理特征的關系，探討ENO1在HCC發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1TCGA和GEO公共數據庫肝癌ENO1基因表達譜數據的分析

1.1.1 數據下載及過濾 下載TCGA數據庫和GEO數據庫中7個數據集(GSE14520，GSE36376，GSE45436，GSE10143，GSE39791，GSE57957，GSE64041)中的HCC ENO1基因表達譜文件及與其匹配的隨訪資料。利用BRB-ArrayTools(版本號V4.5.0Beta2)將基因表達數據、基因描述文件進行數據導入和數據過濾，按向導提示輸入數據要素位置和數據類型。數據過濾過程如下：設置基因在兩組芯片中表達值至少發生1.5倍的改變，如果發生這種改變的樣本數少于總樣本數的20%，該基因將被過濾；并且要求基因表達數據缺失的樣本數不超過50%。

1.1.2 富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA) 根據ENO1 mRNA的表達水平將TCGA數據庫中的肝癌樣本分為ENO1低表達組和高表達組，然后下載目標分析基因集LEE LIVER CANCER SURVIVAL DN(Genes highly expressed in hepatocellular carcinoma with poor survival)、LEE LIVER CANCER SURVIVAL UP(Genes highly expressed in hepatocellular carcinoma with good survival)進行GSEA分析。

1.2HCC組織芯片ENO1蛋白的免疫組化檢測及分析帶有生存期隨訪信息的組織芯片購自上海芯超生物科技公司(貨號HLiv-HCC180Sur-10)，其中HCC組織93例，癌旁正常組織87例，患者隨訪4.0～6.7 a。組織芯片常規脫蠟、水化，用目標檢索溶液(Dako，CA)進行抗原檢索，用體積分數0.3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性15 min，然后用山羊血清、抗生物素蛋白溶液和生物素溶液封閉，加入兔抗人ENO1一抗(稀釋度1150)4 ℃孵育過夜。用生物素化的山羊抗兔二抗(Vector Laboratories，CA)和高靈敏度鏈霉親和素-HRP綴合物探測。將切片在含體積分數0.1%H2O2的Tris-HCl緩沖液中孵育30 min，DAB顯色，蘇木精QS(Vector Laboratories，CA)復染。結果由兩位病理醫師分別判讀，結果有差異時共同判讀。陽性細胞呈棕黃色著色。依據Remmele-評分系統，分別在癌和癌旁標本中選擇5個高倍視野，計算平均每高倍視野陽性細胞百分比并據此分級， <25%、25%～、50%～、≥75%分別為1+、2+、3+、4+級。

1.3統計學處理利用GraphPad Prism 5進行統計分析。HCC與癌旁正常組織中、不同TNM分期和病理分級的HCC組織中ENO1 mRNA表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗；肝癌及癌旁正常組織中、不同TNM分期肝癌組織中ENO1蛋白表達的比較采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1GEO數據庫數據分析結果7個GEO數據集肝癌ENO1 mRNA表達譜分析結果(表1)顯示，HCC組織中ENO1 mRNA表達水平高于癌旁正常組織。

表1 GEO公共數據庫中HCC及癌旁正常組織中ENO1 mRNA表達水平的比較

2.2TCGA數據庫數據分析結果

2.2.1 HCC組織中ENO1 mRNA的表達 共收集TCGA數據庫中的424例樣本，HCC組織374例(其中327例資料完整)，癌旁正常組織50例。HCC組織中ENO1 mRNA表達水平(15.17±1.06)較癌旁組織(14.41±0.32)升高(t=10.555，P<0.001)。資料完整的327例HCC組織標本中， TNMⅢ、Ⅳ期組織中ENO1 mRNA表達水平高于TNMⅠ、Ⅱ期組織，病理分級3、4級組織中ENO1 mRNA表達水平高于1、2級組織，見表2。

表2 不同TNM分期、病理分級HCC組織中ENO1 mRNA表達水平的比較

'2.2.2 預后分析 根據ENO1 mRNA表達水平中位數14.78，將資料完整的327例肝癌患者分為兩組：ENO1 mRNA低表達組(≤中位數，n=164)和ENO1 mRNA高表達組(>中位數，n=163)，針對總體生存期(overall survival，OS)、無進展生存時間(progression-free survival，PFS)分別繪制生存曲線，結果(圖1)顯示，ENO1 mRNA低表達組中位OS、PFS均大于高表達組。OS指從確診開始至因任何原因引起死亡的時間；PFS是指從確診開始至出現腫瘤進展或死亡的時間。

圖1 生存曲線

2.2.3 GSEA分析 基于ENO1表達高低分組，結合下載的目標分析基因集進行GSEA分析，結果(圖2)顯示，與HCC預后不良相關的基因富集在ENO1 mRNA高表達組，而與HCC預后良好相關的基因富集在ENO1 mRNA低表達組。

圖2 GSEA分析

2.3肝癌組織芯片中ENO1蛋白的表達考慮到mRNA和蛋白水平之間存在復雜的調控，我們利用組織芯片免疫組化染色(圖3上)分析了HCC組織中ENO1蛋白的表達。結果顯示：HCC組織中ENO1蛋白的表達高于癌旁正常組織(表3)； TNMⅢ、Ⅳ 期HCC組織中ENO1蛋白表達高于TNMⅠ、Ⅱ期組織(表4)。以1+和2+為低表達，3+和4+為高表達，分別對低表達組和高表達組繪制生存曲線，結果(圖3下)顯示ENO1蛋白低表達組中位OS大于高表達組。

表3HCC及癌旁正常組織中ENO1蛋白的表達例

Z=2.457,P=0.014

表4不同TNM分期HCC組織中ENO1蛋白的表達例

Z=2.042,P=0.041

圖3 HCC組織芯片免疫組化染色(上)及生存曲線(下)圖

3 討論

烯醇化酶，也稱為丙酮酸脫氫酶磷酸酶，有α(ENO1)、β(ENO2)、γ(ENO3)3種同工酶。ENO1主要在大多數組織和胚胎中表達；ENO2主要分布在肌肉組織中；ENO3也稱為神經元特異性烯醇化酶(NSE)，僅在神經元組織中表達。ENO1是一種參與多種病理生理過程的多功能蛋白質，其功能取決于細胞內的分布。即使在氧氣供應充足的條件下，腫瘤細胞仍主要采用糖酵解途徑將葡萄糖代謝為乳酸，攝取能量，這一有氧糖酵解代謝模式也稱為Warburg效應[5]。ENO1作為糖酵解途徑的關鍵酶之一，在糖酵解過程中催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的轉化，對于細胞合成代謝和能量生成至關重要[11]。

腫瘤細胞中的ENO1可被葡萄糖轉運子和糖酵解酶激活，表達上調，在Warburg效應過程中發揮功能[12]。研究[12]證實，ENO1啟動子含有缺氧反應元件，腫瘤細胞有氧糖酵解異常活躍與其ENO1高表達有關； ENO1可以通過增強糖代謝而加速腫瘤細胞的生長。大量研究[7-10, 13]表明，ENO1在多種腫瘤組織中高表達，參與了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，與腫瘤的進展快和預后差有關。閆婷婷等[14]研究發現，ENO1可能是通過調控Notch信號通路促進了HCC的發生。

本研究中，我們首先利用TCGA和GEO公共數據庫分析了HCC組織中ENO1 mRNA的表達特點。TCGA和GEO是建立在人類基因組計劃的研究基礎上的、目前較大的癌癥基因信息數據庫，其標本收集規范，隨訪數據質量高，從而保證了分析結果真實可靠。本研究發現，HCC組織中ENO1 mRNA表達水平高于癌旁正常組織，且TNM Ⅲ、Ⅳ期和病理分級3、4級的HCC組織中ENO1 mRNA表達水平高于TNMⅠ、Ⅱ期和病理分級1、2級者，ENO1 mRNA低表達的HCC患者中位OS、PFS均大于高表達者。隨后，我們采用免疫組化法觀察、分析了ENO1蛋白在HCC組織中的表達，結果顯示HCC組織中ENO1蛋白表達水平也高于癌旁正常組織，并且ENO1蛋白低表達者中位OS大于高表達者，與mRNA水平的分析結果一致。

綜上所述，ENO1可能促進了HCC的發生，并在HCC的侵襲、轉移過程中發揮重要作用。ENO1有望成為一個潛在的HCC發病與進展的預測指標，也可能成為一個HCC精準治療的潛在靶點。