苦參素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓中P53、MDM2及IL-17表達(dá)的影響

劉淑情，呂 瑩，劉方洲，張慧君，張明亮，馬雯迪，朱 琳

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052 2)河南省中醫(yī)藥研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心 鄭州 450004

多發(fā)性硬化癥是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其病理特點(diǎn)為非特異性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、軸突損傷和髓鞘脫失[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)為多發(fā)性硬化癥的經(jīng)典動(dòng)物模型[2]。在EAE模型中，研究者們[3]發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞群具有很強(qiáng)的促炎作用，白細(xì)胞介素17(IL-17)是其中主要的效應(yīng)因子，可以有效介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的興奮過(guò)程，從而有效介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)。核磷蛋白P53是細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要的調(diào)控因子，具有修復(fù)DNA損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、凋亡、自噬等作用，以維持細(xì)胞正常功能[4]。 MDM2是P53的一個(gè)關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，主要通過(guò)調(diào)節(jié)P53的轉(zhuǎn)錄活性、穩(wěn)定性及其自身的泛素化降解，維持細(xì)胞中P53水平[5-6]。

苦參素又名氧化苦參堿, 是一種從傳統(tǒng)豆科植物苦豆草的種子或苦參的根中提取的生物堿[7]。前期研究[8-9]表明，苦參素能夠明顯改善EAE大、小鼠的臨床癥狀。本研究觀(guān)察了苦參素對(duì)EAE小鼠脊髓中P53、MDM2及IL-17表達(dá)的影響，探討苦參素防治EAE的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑及儀器苦參素注射液(批號(hào)：150422304)，0.3 g/mL，購(gòu)自江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司。MOG35-55(批號(hào)：051716)、百日咳毒素(批號(hào)：P2980)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，完全弗氏佐劑(批號(hào)：1001832048)購(gòu)自美國(guó)BD公司；P53抗體、MDM2抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG以及IL-17檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。儀器主要有CUT4062石蠟切片機(jī)、EG1150H石蠟包埋機(jī)、Bilon超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、Thermo酶標(biāo)儀、OLYMPUS病理圖像采集成像系統(tǒng)、OLYMPUS倒置熒光顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)分組雌性C57BL/6小鼠45只，8～10周齡，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物批號(hào)：SCXK20120001。參照文獻(xiàn)[10]方法制備EAE小鼠模型。將MOG35-55(10 mg)溶解于2 mL生理鹽水中，與含有2.5 g/L結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑等體積混合，使用玻璃注射器將混合液在冰上反復(fù)抽打至完全混合，制成油包水型乳白色乳劑，靜置10 min后無(wú)分層為合格。將45只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組3組，每組15只。模型組與治療組小鼠使用戊巴比妥麻醉后，在脊柱背側(cè)中線(xiàn)兩側(cè)，分四點(diǎn)皮下注射上述抗原乳劑進(jìn)行免疫(0.2 mL/只)。在免疫第0天和第2天，3組小鼠均腹腔注射含200 ng百日咳毒素的PBS溶液。治療組于免疫后第13天起腹腔注射苦參素200 mg/kg[9,11]，正常組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥10 d。

1.3EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)估自免疫后第1天開(kāi)始隔天記錄模型組和治療組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分。神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]：0分，沒(méi)有任何臨床癥狀；1分，尾部無(wú)力；2分，后肢無(wú)力；3分，后肢癱瘓；4分，前、后肢均癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。癥狀介于兩者之間時(shí)采用±0.5分計(jì)。由兩名觀(guān)察者分別進(jìn)行評(píng)分，取均值。

1.4組織病理學(xué)檢查免疫后第23天，用預(yù)冷的生理鹽水對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌注，直至心臟變成土黃色。取脊髓腰膨大處在多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，5 μm厚切片，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩ＪＳ嗉顾柚糜?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?duì)切片分別進(jìn)行HE染色和勒克斯光藍(lán)(LFB)髓鞘染色，顯微鏡下觀(guān)察，參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行評(píng)分。HE染色炎癥浸潤(rùn)評(píng)分：0，無(wú)炎癥細(xì)胞；1，少量分散的炎癥細(xì)胞；2，血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，呈袖套樣；3，大量血管袖套樣病變。LFB染色脫髓鞘評(píng)分：0，無(wú)髓鞘脫失; 1，罕見(jiàn)髓鞘脫失；2，少量部位髓鞘脫失；3，大面積髓鞘脫失。使用 Image J 軟件計(jì)算剩余白質(zhì)面積。

1.5脊髓組織中P53和MDM2蛋白的檢測(cè)切片后立即在60 ℃烘箱中烤片1.5 h，脫蠟、水化，然后依次用體積分?jǐn)?shù)為100%、95%、70%和50%的乙醇沖洗5 min，PBS漂洗5 min×3次，然后抗原修復(fù)，再PBS沖洗5 min×3次。將玻片上的PBS擦拭干凈，滴加封閉血清，常溫放置30 min。甩掉血清，略干后，滴加一抗(稀釋度1200)4 ℃冰箱中過(guò)夜。從冰箱中取出后室溫放置30 min，用PBS沖洗5 min×3次，滴加熒光二抗常溫放置15 min，用PBS漂洗5 min×3次，封片。熒光顯微鏡下觀(guān)察染色結(jié)果并捕獲圖片，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)靶蛋白表達(dá)情況進(jìn)行定量分析。

1.6脊髓組織中IL-17的檢測(cè)取脊髓組織50～100 mg置入離心管中，按0.05 g/mL加入0.01 mol PBS溶液，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)制成乳白色混懸液，12 000 r/min離心10 min，收集上清，ELISA法檢測(cè)IL-17含量，操作按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。模型組與治療組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，炎癥浸潤(rùn)評(píng)分和脫髓鞘評(píng)分的比較，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；3組小鼠剩余白質(zhì)面積,P53、MDM2蛋白以及IL-17表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠癥狀表現(xiàn)正常組小鼠未表現(xiàn)出EAE癥狀。模型組小鼠在免疫后的第11天起相繼發(fā)病，表現(xiàn)為皮毛松亂、精神不振、尾部張力消失、步態(tài)笨拙；隨著癥狀逐漸加重，出現(xiàn)四肢無(wú)力、體重下降，繼而全身癱瘓；癥狀嚴(yán)重時(shí)處于瀕死狀態(tài)。治療組小鼠的癥狀亦逐漸加重，神經(jīng)功能評(píng)分不斷升高，但癥狀加重速度較模型組緩慢。與模型組相比，治療組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分降低(表1)。

2.2組織病理學(xué)表現(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。與正常組相比，模型組小鼠剩余白質(zhì)面積減少，炎癥浸潤(rùn)程度及脫髓鞘程度均增加；與模型組比較，治療組小鼠炎癥浸潤(rùn)評(píng)分和脫髓鞘評(píng)分均降低，剩余白質(zhì)面積增加。

表1 模型組和治療組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較

F組間=40.352，F(xiàn)時(shí)間=82.134，F(xiàn)交互=5.421，P<0.001

A:治療組；B：模型組；C：正常組；1 ：LFB染色(×200)；2：HE染色(×100)

表2 3組小鼠組織病理學(xué)表現(xiàn)的比較

*：與正常組比較，P<0.01；#：與模型組比較，P<0.01

2.3 3組小鼠脊髓中P53、MDM2蛋白及IL-17的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。與正常組比較，模型組小鼠脊髓中P53表達(dá)降低，MDM2和IL-17表達(dá)升高；與模型組比較，治療組小鼠P53表達(dá)增加，MDM2和IL-17表達(dá)下降。小鼠脊髓組織中IL-17與P53的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.665，P<0.001)。

A：正常組；B：模型組；C：治療組；1：P53；2：MDM2

表3 3組小鼠脊髓中P53、MDM2及IL-17蛋白表達(dá)的比較

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

3 討論

多發(fā)性硬化癥主要的病理特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失和軸突損傷。在EAE疾病進(jìn)程中，外周免疫細(xì)胞可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原提呈細(xì)胞作用而引起免疫反應(yīng)，進(jìn)而促使炎癥因子的釋放，最終造成髓鞘的脫失[14]。促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥細(xì)胞的凋亡或抑制炎癥細(xì)胞表達(dá)成為近年來(lái)多發(fā)性硬化癥研究的熱點(diǎn)。P53/MDM2作為炎癥細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在多發(fā)性硬化等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有巨大的研究前景。

TH17細(xì)胞是在自身免疫疾病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)的，主要分泌IL-17。IL-17可以誘導(dǎo)多種促炎因子和趨化因子的表達(dá), 與多種免疫應(yīng)答性疾病緊密相關(guān)。研究[15]發(fā)現(xiàn)，給予EAE小鼠抗IL-17抗體處理后，麻痹癥狀得到延緩，并且已發(fā)生的麻痹明顯減輕。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EAE小鼠脊髓中IL-17表達(dá)明顯升高，而經(jīng)過(guò)苦參素治療的EAE小鼠脊髓中IL-17的表達(dá)顯著降低。P53蛋白主要表達(dá)在炎癥細(xì)胞，參與EAE的發(fā)病過(guò)程，其表達(dá)量與EAE癥狀評(píng)分呈正相關(guān)[16]。MDM2作為P53下游重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量的多少與EAE的臨床癥狀也緊密相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，EAE小鼠脊髓內(nèi)P53的表達(dá)較正常組明顯降低，而MDM2的表達(dá)顯著增加。推測(cè)小鼠在正常狀態(tài)下，體內(nèi)的炎癥因子在P53的調(diào)控下可以被及時(shí)清除；當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到病理?yè)p傷等刺激后，P53的表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞不能被及時(shí)清除，積累到一定量后即引起脫髓鞘與軸索損傷。經(jīng)苦參素治療的EAE小鼠，其神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，同時(shí)炎癥浸潤(rùn)及脫髓鞘得到有效緩解，P53表達(dá)升高，而MDM2的表達(dá)顯著降低。通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠脊髓中P53與IL-17的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。由此可見(jiàn)，P53可能通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性，抑制IL-17的表達(dá)，進(jìn)而減輕了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及脫髓鞘程度。

綜上所述，苦參素可能通過(guò)調(diào)節(jié)P53/MDM2平衡，有效緩解EAE小鼠的臨床癥狀，使炎癥浸潤(rùn)和脫髓鞘程度顯著減輕。