穩定表達熒光素酶基因的TC-1細胞系的構建

韓笑笑，劉麗雅，譚超月，李 元，高君碧，韓麗萍

鄭州大學第一附屬醫院婦科；河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，主要病因是人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，其中HPV16、18是主要致病型[1-2]。TC-1細胞為含有HPV16型E6/E7基因的小鼠肺上皮細胞，通過接種TC-1細胞于小鼠宮頸陰道黏膜，可構建宮頸癌動物模型，進行相關腫瘤實驗研究。熒光素酶(luciferase)報告基因作為一種常用的報告基因系統，在細胞中的背景非常低，生物熒光穿透力強，可用以標記腫瘤細胞，通過活體成像系統直接觀察細胞在體內的生長、轉移及對藥物的反應等情況，并且能無創客觀地對荷瘤模型的微小癌灶進行實時監測[3-4]。為此，作者構建了表達熒光素酶報告基因的慢病毒并感染TC-1細胞，通過篩選建立穩定表達熒光素酶基因的TC-1細胞株，為下一步構建可靠、直觀、方便、靈敏的宮頸癌動物模型及相關研究提供示蹤細胞來源。

1 材料與方法

1.1材料TC-1細胞株購自北京北納創聯生物公司，293T細胞購自上海信裕生物科技有限公司。質粒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-puro購自美國System Bioscience公司，DNA切膠快速純化回收試劑盒購自美國Axygen公司，質粒提取試劑盒、嘌呤霉素購自美國Sigma公司，DNA內切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，KOD plus DNA聚合酶購自日本TOYOBO公司，DNA轉染試劑lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自以色列BI公司，熒光素購自美國Caliper公司，PLB購自上海玉博生物科技有限公司，DH5 感受態細胞購自鄭州基美生物公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司。PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，CO2培養箱購自美國Thermo公司，Centro LB960微孔板發光儀，Xenogen IVIS?50 成像系統。

1.2目的基因的獲得根據從GenBank 查詢的熒光素酶基因設計引物，LUCF：5’-GCTCTAGAATG GAAGACGCCAAAAAC-3’， LUCR：5’-GCTCTAGAAT TACACGGCGATCTTTCC-3’，擴增片段1 700 bp。 載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用XbaⅠ進行酶切，以pGL3-basic為模板，PCR擴增目的基因，DNA切膠快速純化回收試劑盒回收目的片段。

1.3質粒載體的構建①連接：在0.5 mL EP管內加入限制性內切酶處理好的載體DNA 500 ng(載體DNA與插入片段的物質的量之比為1 ∶1～1 ∶6，DNA總量小于500 ng)，2 μL 10×buffer，1 μL Ligase DNA合成酶，用ddH2O將反應體積調整至20 μL， 黏性末端16 ℃保溫3 h。②轉化：將連接液加入DH5α 感受態細胞中，水浴30 min，42 ℃熱敷90 s，水浴5 min，加入1 mL LB培養基，37 ℃搖1 h，涂含有Amp抗性的LB平板，過夜培養，次日觀察克隆生長情況。③鑒定：挑選單克隆菌落，加入Fast Digest酶以及50 μL LB培養基，混勻，取菌液進行PCR鑒定。PCR條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，30 個循環；68 ℃ 5 min。100 V 電泳40 min。條帶正確的克隆為pLenti-Luc。

1.4Lenti-Luc慢病毒的包裝將293T細胞接種于10 cm平皿中，細胞數為3×106個/皿。第2天觀察細胞融合度達約80%換液，用含體積分數10%胎牛血清、無雙抗的DMEM培養液。配制磷酸鈣轉染體系，CaCl2緩沖液中加入12 μg 的pCMV-Δ8.2，10 μg的pCMV-VSV-G，22 μg慢病毒表達質粒pLenti-Luc，用ddH2O將體積調至500 μL，加入500 μL pH 7.0的2×HEPPS緩沖液漩渦振蕩4 s，以成滴形式加入相應的平皿中，37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養6 h或過夜，換液為正常培養液，37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養24 h，觀察細胞狀態，48 h收集病毒上清，續加入5 mL正常培養基繼續培養，72 h再次收集病毒上清。

1.5TC-1細胞感染和篩選將TC-1細胞接種于72孔板中，每孔細胞數為1×105；調Lenti-Luc病毒滴度為1×107PFU/mL，依MOI=100感染細胞；6 h后換液用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基；3 d后用20 mg/L嘌呤霉素進行篩選；嘌呤霉素加壓篩選2周后進行熒光素酶活性檢測。

1.6熒光素酶活性檢測①熒光素酶活性鑒定:取1×106個TC-1細胞及TC-1-Luc細胞，PBS清洗后加入1×PLB 250 μL，室溫下輕緩晃動培養15 min,把裂解液轉移到1.5 mL的EP管中，10 000 r/min離心5 min，將上清轉入新試管中，72孔不透明板中每孔加入20 μL PLB裂解液,實驗重復5次。通道1加入配制好的熒光素工作液,通道2加入PBS, 調用雙熒光素酶檢測程序進行測定。②熒光成像:將TC-1及TC-1-Luc細胞接種于72孔板中，進行倍比稀釋。次日，加入適量熒光素，使終濃度為100 mg/L，室溫靜置3 min，在Xenogen IVIS?50 成像系統中進行圖像采集和數據分析。

2 結果

2.1慢病毒表達載體pLenti-Luc的酶切鑒定和測序載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用XbaⅠ進行酶切，以pGL3-basic為模板，PCR擴增，得到一條約1 700 bp的條帶(圖1)，與預期相符。將得到的熒光素酶目的片段產物與載體連接和轉化，挑取一定數量克隆進行酶切鑒定，菌落PCR產物如圖2。選擇2、3號克隆測序，2號測序結果與已知的熒光素酶序列完全一致，表明pLenti-Luc構建成功。

M1、M2：DNA Marker；1、2：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體酶切產物；3：熒光素酶的PCR產物

圖1載體酶切及基因PCR電泳結果

M：DNA Marker；1～10：不同菌落

2.2穩定細胞系的鑒定雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，TC-1-Luc組熒光素酶活性較TC-1細胞升高。熒光成像結果表明，隨著細胞數量的增加，熒光強度逐漸增強(圖3)。

圖3 熒光成像結果

3 討論

TC-1細胞系可持續表達E6、E7蛋白，具有和宮頸癌細胞相似的生物學行為，使建立鼠宮頸癌原位移植模型成為可能[5]。既往動物實驗主要局限于肉眼觀察及處死荷瘤動物模型后的腫瘤稱重、體積測量及組織切片病理觀察，存在動物倫理學、不可避免的實驗誤差及無法連續動態觀察等諸多弊端，導致研究缺乏連續性和整體性。近年分子成像技術的應用實現了對小動物腫瘤模型實時、連續、無創觀察，使在微觀水平動態監測腫瘤細胞在動物體內的生長、轉移等情況成為可能，為我們在分子水平上研究腫瘤提供了重要手段[6-9]。

腫瘤細胞通常沒有特殊的光學特性，因此利用特異性標記物標記腫瘤細胞，使其成為一種光源，然后種植于活體可實現腫瘤細胞的活體內成像[10]。Katz等[11]通過建立穩定表達紅色熒光蛋白的原位胰腺癌裸鼠模型，利用體外活體成像系統對化療藥物的藥效進行研究。國內有學者[12]構建了熒光素酶基因穩定表達的間充質干細胞系，為研究干細胞在體內的歸巢現象提供了示蹤細胞來源?；铙w成像技術主要采用生物發光和熒光兩種技術，生物發光技術是利用熒光素酶基因標記細胞或遺傳物質，荷載外源性底物熒光素，在動物模型體內發生生物化學反應，利用光學檢測儀器進行檢測[13-14]。本實驗利用檢測較方便的生物發光技術，將熒光素酶基因轉染TC-1腫瘤細胞，穩定表達的熒光素酶在ATP、O2和底物熒光素存在條件下，可發生特異性的酶促反應從而發光。該技術能夠靈敏客觀地實時連續監測腫瘤病灶的變化進展，使其量化的結果更具說服力，而且生物發光技術無放射性，對監測的腫瘤細胞、動物及操作者無害，具有較高的安全性[15]。

構建穩定表達熒光素酶基因的TC-1細胞系是建立宮頸癌動物模型并進行活體監測的基礎。Sun等[16]通過建立表達熒光素酶基因的原位宮頸癌裸鼠模型，進行HPV疫苗在宮頸癌治療中的研究。我們通過構建表達熒光素酶慢病毒載體，包裝重組慢病毒，感染TC-1細胞系，經篩選獲得穩定表達熒光素酶的TC-1細胞，為宮頸癌動物模型活體研究奠定了良好的基礎。