N-乙酰半胱氨酸對氟誘導(dǎo)雄性大鼠海馬細(xì)胞凋亡及ATF-6蛋白表達(dá)的影響

劉曉蕙，劉文一，李 博，裴蘭英，王瑾瑾，閆國立

1)河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)科 鄭州 450046 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)部 鄭州 450052 3)河南大學(xué)護(hù)理學(xué)院 河南開封 475004

慢性氟中毒主要引起氟斑牙和氟骨癥。隨著人們對氟中毒發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的不斷提高，已明確慢性氟中毒是一種全身性疾病，可造成機(jī)體多系統(tǒng)的毒性損傷[1]。近年來，氟暴露對神經(jīng)系統(tǒng)的影響和作用機(jī)制研究受到了廣泛的關(guān)注，氟對海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響以及相關(guān)基因的表達(dá)已有研究報道[2-4]。但有關(guān)N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)對氟誘導(dǎo)雄性大鼠海馬細(xì)胞凋亡及ATF-6蛋白表達(dá)的影響很少見報道。NAC由L-半胱氨酸加上乙酰基形成，是細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的前體。NAC分子中含有活性巰基，對體內(nèi)超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等氧自由基具有明顯的拮抗作用，可對抗不同原因所致的氧化損傷[5-6]。本研究選用雄性SD大鼠經(jīng)灌胃染毒建立氟中毒模型，同時給予抗氧化劑NAC加以干預(yù)，通過大鼠海馬體質(zhì)量、海馬組織氟含量、海馬細(xì)胞凋亡和海馬組織ATF-6蛋白表達(dá)水平檢測，觀察NAC對氟誘導(dǎo)大鼠上述指標(biāo)的影響，為預(yù)防氟對海馬細(xì)胞的損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器氟化鈉(NaF)購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；NAC購于美國Sigma公司；鹽酸購于北京化工廠；二甲苯、乙醇均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木素染色液購于南京建成生物工程研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒、ATF-6多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；組織勻漿器(海門愛苯德)；高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；氟離子選擇電極(上海電元器件廠)；亞光YB-7B石蠟包埋機(jī)(泰維電子有限公司)；LEICAASP200自動切片機(jī)(LEICA公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2實(shí)驗動物分組及處理4～5周齡、體重在80～100 g之間的雄性健康SD大鼠48只，由河南省實(shí)驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK(豫)2010-0002。動物飼養(yǎng)在SPF級實(shí)驗動物房。大鼠檢疫1周無異常后，進(jìn)行稱重并編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對照組、NaF組、NaF+NAC組和NAC組，每組12只。對照組給予生理鹽水[10 mL/(kg·d)]；NaF組給予NaF溶液[25 mg/(kg·d)]；NaF+NAC組給予NaF溶液[25 mg/(kg·d)]+NAC溶液[150 mg/(kg·d)]；NAC組給予NAC溶液[150 mg/(kg·d)][7-9]。每周連續(xù)灌胃6 d后停灌1 d，共灌胃7周。

1.3海馬體質(zhì)量測定大鼠染毒7周后，采用水合氯醛腹腔注射麻醉并處死，按照《大鼠腦立體定向圖譜》取大腦海馬體，剝離干凈稱量。

1.4海馬組織氟含量測定采用酸浸-氟離子選擇電極法[10]。先制備海馬組織標(biāo)本，再通過酸浸提取15 mL離心液，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定海馬組織氟含量。

1.5海馬細(xì)胞凋亡檢測先將海馬組織石蠟切片脫蠟至水化，再使用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒進(jìn)行檢測。染色后將切片置于400倍光鏡下觀察，藍(lán)紫色為正常細(xì)胞，棕色為凋亡細(xì)胞。每個樣本制備3張切片，每張切片鏡檢500個細(xì)胞，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6海馬組織ATF-6蛋白水平檢測采用免疫組化法檢測大鼠海馬組織中ATF-6蛋白的表達(dá)情況。海馬組織石蠟切片脫蠟后，用體積分?jǐn)?shù)3%雙氧水處理10 min，不銹鋼壓力鍋中加入1 500～3 000 mL pH=6.0的枸櫞酸鹽緩沖液對切片進(jìn)行熱修復(fù)組織抗原，PBS洗滌。BSA封閉液室溫封閉20 min。依次滴加1100 ATF-6抗體(4 ℃過夜，PBS洗滌)、二抗IgG(37 ℃水浴30 min，PBS洗滌)。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。利用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件在400倍視野下測定光密度值，每張切片選取5個視野，取其平均值作為ATF-6蛋白的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。不同組間海馬體質(zhì)量、海馬組織氟含量、海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)和海馬組織中ATF-6蛋白表達(dá)水平的比較均采用2×2析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠海馬體質(zhì)量和海馬組織氟含量比較

NaF可減少海馬體質(zhì)量，NAC可增加海馬體質(zhì)量，NaF和NAC對海馬體質(zhì)量的交互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義； NaF可升高海馬組織氟含量，NAC可降低海馬組織氟含量，NaF和NAC對海馬組織氟含量的交互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)和海馬組織中ATF-6蛋白表達(dá)水平比較NaF可升高海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)和海馬組織中ATF-6蛋白相對表達(dá)量，NAC可降低海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)和海馬組織中ATF-6蛋白相對表達(dá)量；NaF和NAC對海馬細(xì)胞凋亡和海馬組織中ATF-6蛋白相對表達(dá)量的交互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表1 各組大鼠海馬體質(zhì)量和海馬組織氟含量比較

表2 各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)和海馬組織中ATF-6蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

3.1各組大鼠海馬體質(zhì)量和海馬組織氟含量分析

該研究結(jié)果顯示，NaF可減少海馬體質(zhì)量，究其原因可能是NaF對海馬細(xì)胞造成損傷，引起細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞出現(xiàn)空泡[11]。NAC可增加海馬體質(zhì)量，而且結(jié)果提示NAC可拮抗NaF對海馬細(xì)胞的損傷，可能原因是NAC可降低細(xì)胞氧化損傷，提高細(xì)胞活性[12]。NaF可升高海馬組織氟含量，說明氟可在海馬組織中蓄積，并成為氟對海馬細(xì)胞損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，與王瑞等[13]研究結(jié)果一致。NAC可降低海馬組織氟含量，而且結(jié)果提示NAC可拮抗NaF在海馬組織中蓄積，該結(jié)果還需進(jìn)一步研究來論證。

3.2各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用的細(xì)胞自主的有序死亡。本研究結(jié)果顯示，NaF可升高海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)，說明NaF可誘導(dǎo)海馬細(xì)胞凋亡，與馬小惠等[14]研究結(jié)果一致。NAC可降低海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)，而且結(jié)果提示NAC可拮抗NaF誘導(dǎo)海馬細(xì)胞凋亡。分析原因認(rèn)為，NAC作為一種含巰基的抗氧化劑，能干擾活性氧，清除生成的自由基，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活性，抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，并在一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)中起重要作用[12,15]。

3.3各組大鼠海馬組織中ATF-6蛋白表達(dá)水平分析細(xì)胞凋亡信號通路一般可分為3類：線粒體損傷途徑、死亡受體活化途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑。其中ERS是近年來發(fā)現(xiàn)的一種啟動凋亡的新途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是新生蛋白折疊的地方，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變，出現(xiàn)炎癥、氧化應(yīng)激等刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，未折疊蛋白就會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚并引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)[16]。UPR可以加速處理未折疊的蛋白或錯誤折疊的蛋白，以便更好地維持細(xì)胞的正常生理功能。假如這種損傷長期進(jìn)行下去，就會使細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)得不到及時恢復(fù)，勢必引起細(xì)胞凋亡，信號由促生存向促凋亡轉(zhuǎn)換[17]。ERS發(fā)生時，UPR可激活3種轉(zhuǎn)錄因子，ATF-6是其中之一[18]。ATF-6蛋白可以觸發(fā)ERS相關(guān)的促凋亡信號通路。本研究結(jié)果顯示，NaF可升高海馬組織中ATF-6蛋白相對表達(dá)量，說明NaF可誘導(dǎo)大鼠海馬細(xì)胞發(fā)生ERS，UPR激活A(yù)TF-6轉(zhuǎn)錄因子，ATF-6蛋白表達(dá)量增高。NAC可降低海馬組織中ATF-6蛋白相對表達(dá)量，而且結(jié)果提示NAC可抑制NaF誘導(dǎo)的海馬組織中ATF-6蛋白相對表達(dá)量的增高，與閆婷[9]的研究結(jié)果相似。

綜上所述，NAC能夠保護(hù)海馬細(xì)胞避免NaF引起的凋亡損傷，也能拮抗NaF誘導(dǎo)海馬細(xì)胞發(fā)生ERS導(dǎo)致的ATF-6蛋白表達(dá)的上調(diào)。提示NaF可誘導(dǎo)海馬細(xì)胞發(fā)生ERS，繼而引起其發(fā)生凋亡。