MEF2A RNA干擾對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊及血清Lp-PLA2、MCP-1表達的影響

周文平，周應乾，張 輝，張金盈

1)鄭州大學第三附屬醫院心內科 鄭州 450052 2)蘇州大學醫學部 江蘇蘇州 215000 3)鄭州大學第一附屬醫院心內科 鄭州 450052

肌細胞增強因子2A(myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)是一種新發現的維護血管內皮穩定性的重要生物活性物質，MEF2A表達水平的降低是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成的危險標志。作者用載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠制備頸總動脈AS動物模型，用攜帶MEF2A siRNA的慢病毒感染模型小鼠頸動脈斑塊，觀察MEF2A表達下降對AS斑塊形成的影響及對脂蛋白相關磷脂酶A2(lipoprotein associated phospholipase A2，Lp-PLA2)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)表達的影響，探討MEF2A在AS發生發展過程中的可能作用，為AS的診治提供指導和依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物10周齡雄性apoE-/-小鼠45只購自北京大學醫學部，遺傳背景C55/BL5。在常規小鼠飼料中添加質量分數15%脂肪和質量分數0.25%膽固醇粉高脂喂養，調節室溫20～22 ℃，去除噪音等應激因素干擾。

1.2MEF2AsiRNA慢病毒的構建選擇上海吉瑪生物制藥技術有限公司制作的MEF2A siRNA慢病毒和陰性對照(negative control，NC)慢病毒，兩者均含有綠色熒光蛋白序列，即5’-GGGTCTTAG TATATTTCTTGG-3’，構建的慢病毒均標記有滴度為1×105TU/mL的綠色熒光蛋白。以病毒感染復數=50來確定慢病毒感染效率。

1.3動物模型的構建采用高脂飼料喂養apoE-/-小鼠，喂養2周后通過左頸動脈縮窄手術放置套管，誘發小鼠頸總動脈AS病變形成。小鼠均禁食12 h，采用戊巴比妥鈉按40 mg/kg進行腹腔注射。達到麻醉效果后，將小鼠腹面朝上固定在手術臺上，充分暴露頸前三角區，按照手術路徑分離左側頸總動脈，首先固定該動脈，然后將縮窄性硅膠管放在血管周圍(硅膠管長度3 mm、內徑0.3 mm)并固定套管。術后將小鼠放回鼠籠繼續喂養。術后5周解除套管，觀察小鼠左頸總動脈，斑塊形成提示AS模型制作成功。

1.4實驗分組模型小鼠采用隨機數字表法分為3組，即MEF2A RNAi組、NC組和對照組，每組15只。通過定位，短暫阻斷上游血流，切開動脈斑塊，30°方向進針，MEF2A RNAi組動脈斑塊局部用滴度為5×105TU/mL的RNAi慢病毒懸液進行注射，NC組動脈斑塊局部用滴度為5×105TU/mL的NC慢病毒懸液進行注射，對照組動脈斑塊局部用生理鹽水進行注射。然后縫合血管，術后繼續高脂喂養。5周后再次手術游離出左側頸總動脈，截斷取出，先將左頸總動脈標本用生理鹽水充分漂洗，然后用40 g/L多聚甲醛浸泡12 h，達到固定效果后，取出標本，OCT包埋，制作5 μm厚冰凍切片。進行油紅染色(ORO染色)，染色后的組織標本在光學顯微鏡下觀察，測定頸動脈斑塊厚度和面積。

1.5AS斑塊內MEF2A、Lp-PLA2和MCP-1mRNA表達的檢測取實驗小鼠新鮮斑塊標本，采用real-time PCR法檢測MEF2A、Lp-PLA2和MCP-1 mRNA的表達。采用2-ΔΔCt法分析各因子的相對表達量，以β-actin為內參照。標本總RNA的提取及RNA濃度、純度和完整性檢測均按珠海貝索生物技術有限公司試劑盒所規定的步驟和程序進行。

1.6血清MEF2A、Lp-PLA2、MCP-1水平的測定

小鼠球后靜脈叢抽血，血樣經3 000 r/min離心15 min取上層血清，采用ELISA法測定血清MEF2A、Lp-PLA2、MCP-1水平。所有操作步驟均按北京康為世紀生物制品有限公司試劑盒說明書進行。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行統計學處理。3組間AS斑塊內MEF2A、Lp-PLA2、MCP-1 mRNA相對表達量和血清水平的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1MEF2ARNAi對AS斑塊形成的影響MEF2A RNAi組、NC組和對照組AS斑塊ORO染色結果見圖1。MEF2A RNAi組斑塊厚度和面積較對照組和NC組升高；對照組與NC組斑塊面積及厚度比較，差異無統計學意義(表1)。

2.2MEF2ARNAi對斑塊內MEF2A、Lp-PLA2、MCP-1mRNA表達的影響結果見表2。對照組與NC組相比,斑塊內MEF2A、Lp-PLA2、MCP-1 mRNA表達差異無統計學意義；與對照組及NC組相比，MEF2A RNAi組斑塊內MEF2A mRNA表達明顯降低，而Lp-PLA2、MCP-1 mRNA表達明顯升高。

2.3MEF2ARNAi對3組小鼠血清MEF2A及Lp-PLA2、MCP-1水平的影響結果見表3。 MEF2A RNAi組與對照組及NC組相比，血清MEF2A水平明顯降低，Lp-PLA2和MCP-1水平明顯升高；對照組與NC組相比，血清MEF2A、Lp-PLA2和MCP-1水平差異無統計學意義。

A：MEF2A RNAi組；B：NC組；C:對照組圖1 MEF2A RNAi組、NC組和對照組AS斑塊比較(ORO染色，×200)

表1 對照組、NC組和MEF2A RNAi組AS斑塊厚度和面積的比較

*：與對照組和NC組相比，P<0.05

表2 對照組、NC組和MEF2A RNAi組斑塊內MEF2A、Lp-PLA2及MCP-1 mRNA表達的比較

*：與對照組和NC組相比，P<0.05

表3 3組小鼠血清MEF2A、Lp-PLA2、MCP-1水平的比較

*：與對照組和NC組相比，P<0.05

3 討論

AS是嚴重威脅人類健康的常見病、多發病。AS的發生是一個慢性炎癥過程，其重要特征性表現是單核細胞遷移浸潤血管壁，脂質成分沉積，炎癥過程和病理過程呈持續高反應狀態，導致斑塊形成，最終形成AS[1]。

apoE-/-小鼠AS模型是通過手術方法，給予高脂喂養，人為形成AS和AS斑塊，是公認的AS模型。血管內皮和血管壁結構和功能的變化是AS病變的基礎。MEF2A與血管內膜完整性和血管內皮細胞的生存密切相關，可與血管平滑肌細胞中特異性基因調控區A/T序列結合，調控血管平滑肌細胞靶基因轉錄[2]。血管內皮細胞ERK5/MEF2通路通過激活KLF2轉錄因子調節血流介導的內皮完整性，細胞內MEF2-HDAe信號在維持血管的完整性方面具有重要作用[3]。抑制MEF2A活性可激活單核巨噬細胞系統，大量單核細胞遷移到動脈內皮下并促進MCP-1生成，激發血管平滑肌細胞的增殖，促進斑塊形成，加速AS病理過程[4]。Lp-PLA2是由單核巨噬細胞系統分泌的與AS發生發展密切相關的炎性標志物和調節介質，其產生過程與動脈壁炎性過程、血管硬化形成和斑塊病理程度相一致，對心血管事件發生具有預測作用[5]。實驗[6]表明，AS斑塊中甘油磷脂二位酰基酯鍵通過Lp-PLA2水解，產生促炎因子，促發單核細胞遷移，浸潤血管內皮，成為動脈慢性炎性過程和AS斑塊不穩定性的關鍵環節。同時，Lp-PLA2是ox-LDL產生的啟動因素，促進脂質在血管壁的浸潤和沉積，成為AS啟動、加重和病理演變的關鍵性酶[7]。MCP-1激活單核巨噬細胞系統，啟動脂質沉積和血小板凝血機制，構建AS的早期特有病變[8]。Lp-PLA2可有效促進MCP-1的生成并促進MCP-1發揮單核細胞活化、趨化和轉化作用，從而啟動、加速AS和斑塊的形成[9-10]。在AS斑塊部位采用慢病毒介導的RNAi有效抑制MEF2A活性，斑塊中相關因子Lp-PLA2、MCP-1活性增強，AS和斑塊病變加重，說明MEF2A RNAi對apoE-/-小鼠AS及MEF2A、Lp-PLA2、MCP-1表達的影響。

本實驗發現，與對照組和NC組相比，MEF2A RNAi組頸動脈AS斑塊易于形成，其血清中Lp-PLA2、MCP-1水平明顯升高。抑制MEF2A可以打破血管內皮功能和結構穩定，促進Lp-PLA2、MCP-1在血清中和血管壁的高表達，對AS的發生發展具有促進作用。