小鼠T279基因敲除胚胎干細胞的構建

楊 超，王朝亮，張天標，殷正偉，王 瑞

鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科 鄭州 450052

不育已成為世界范圍的生殖難題[1]。不育癥的發生與睪丸特異性基因密切相關[2-4]。T279是我們實驗室首次鑒定出的一個睪丸特異性表達新基因，其僅在小鼠睪丸組織中特異性表達，人和小鼠T279基因的核苷酸序列有64.5%的同源性，說明T279是一個人-小鼠同源性基因；前期的研究[5]證實T279蛋白在無精癥患者睪丸組織中的表達減少或消失。為從整體水平探索T279基因在精子發生中的功能和相關機制，作者利用打靶載體技術構建了小鼠T279基因敲除胚胎干細胞(ES細胞)模型，為進一步建立T279基因敲除小鼠模型奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料含T279基因的129 BAC質粒(編號bMQ-355C23)購于Geneservice公司；PL253、PL452質粒由 (美國)國立癌癥研究所惠贈；DH5α、EL350大腸桿菌及小鼠129品系原代ES細胞由本實驗室保存。限制性核酸內切酶(NotⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅤ、KpnⅠ)，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，T4 DNA 連接酶，堿性磷酸酶(CIAP)購自TaKaRa生物公司；氯霉素、卡那霉素、氨芐青霉素購自上海生工生物工程有限公司；Biospin PCR產物純化試劑盒、Biospin切膠回收試劑盒購自杭州博日科技有限公司；Tryptone、Yeast extract購自英國OXOID公司；質粒中抽試劑盒購自Promega公司；DMEM、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；絲裂霉素 C、G418、更昔洛韋購自Sigma公司；PBS、Southern blot轉膜液、預雜交液、雜交液、洗膜液由本實驗室配制；Zeta-probe Blot膜購自Bio-Rad公司；α-P32-dCTP購自PerkinElmer公司。

1.2PCR引物和Southernblot探針引物根據129 BAC質粒序列分析結果，結合小鼠T279基因序列(GenBank登錄號：NM_024279)，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計5對引物。引物由南京金絲瑞生物科技有限公司合成。T279-1F：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCACTCGATGACAGAACAAA

TCC-3’，T279-1R：5’-CCCAAGCTTCTTCTCTCTGCTGAAAGGACAG-3’ ，用來擴增Retrieving-5’同源臂，并分別引入NotⅠ和HindⅢ酶切位點。T279-2F：5’-CCCAAGCTTGTTCCACAGGAGAAAGTGGTTC-3’，T279-2R：5’-CGGGATCCACATCAGTGACTTGGAGCT GTG-3’ ，用來擴增Retrieving-3’同源臂，并分別引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點。Lxp-F：5’-CTCAGGGTGCCAGGGGAAATCCTGGTTTCCACAGACACAGCTGCTCCGTGGGTAACGCCTTGCCCATCTTGATATCGCAGCCCAATTCCGATC ATA-3’，Lxp-R：5’-CAGGGGAGGCTGTGAGGAGACAGTTGTCTCACACTGTGCTGTCCTCCCATGTTGCTCCTGTGAGGCAGGCGAGCTCGG TACCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3’ ，用來擴增loxp-neo-loxp片段，并分別引入EcoRⅤ和KpnⅠ酶切位點。EcoRⅤ-F：5’-AGCCACAGCTATGGAGAGT GATC-3’，EcoRⅤ-R：5’-GAGATTGGTCCCTGGA CAGTG-3’ ，用來擴增5’端Southern blot 探針。KpnⅠ-F：5’-CTGCATGTGAGACACTCACCAG-3’，KpnⅠ-R：5’-CCATTCTTCTGCCAGCACTGAC-3’，用來擴增3’端Southern blot 探針。

1.3基因敲除策略小鼠T279(GenBank登錄號：NM_024279)基因定位于染色體8A2位點，含7個外顯子，編碼一個含182個氨基酸、相對分子質量為19 940 的蛋白。由于外顯子1、2之間以及外顯子5、6之間內含子超過8 kb，不易操作，所以我們決定敲除外顯子2～5，共8 333 bp。見圖1。

圖1 小鼠T279基因敲除策略

1.4PL253-T279小載體的構建提取129 BAC質粒DNA，分別用兩對引物T279-1F、T279-1R和T279-2F、T279-2R擴增Retrieving-5’及 Retrieving-3’ 同源臂。PCR反應體系如下：PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(2.5 u/μL) 0.5 μL、dNTP 混合物(2.5 mmol/L) 4 μL、10 μmmol/ L上下游引物各 1 μL、5×PrimeSTAR buffer(Mg2+plus)10 μL、BAC-DNA 1 μL、MilliQ 水32.5 μL。PCR程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。上述PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收后，用NotⅠ+HindⅢ酶切Retrieving-5’同源臂，用HindⅢ+BamHⅠ酶切Retrieving-3’同源臂。同時用NotⅠ+BamHⅠ酶切PL253質粒并回收PL253大片段。將上述酶切回收后的Retrieving-5’ 同源臂、Retrieving-3’ 同源臂、PL253大片段用T4連接酶連接，連接產物經HindⅢ線性化后電轉染到含129 BAC質粒的EL350菌中，在Retrieving-5’及 Retrieving-3’同源臂的介導下，129 BAC質粒與PL253連接產物發生同源重組，同源重組正確的即為PL253-T279小載體，見圖2。

圖2 同源重組正確的PL253-T279小載體

1.5PCR擴增loxp-neo-loxp片段提取PL452質粒DNA，用引物Lxp-F、Lxp-R PCR擴增loxp-neo-loxp片段，并分別引入70 bp同源臂LxpF和LxpR以及EcoRⅤ和KpnⅠ酶切位點。反應體系如下：PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 (2.5 u/μL) 0.5 μL、dNTP 混合物 (2.5 mmol/L) 4 μL、8 mmol/L上、下游引物Lxp-F、Lxp-R 各1 μL、5×PrimeSTAR buffer(Mg2+plus)10 μL、BAC-DNA 1 μL、MilliQ 水32.5 μL。PCR程序：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸150 s，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收PCR產物。

1.6T279打靶載體的構建通過電轉染方法將loxp-neo-loxp片段電轉染到含PL253-T279小載體的EL350菌里，在LxpF和LxpR同源臂的介導下，PL253-T279和loxp-neo-loxp片段發生同源重組。將電轉染后的菌液接種到氨芐青霉素LB平板，經過無菌培養后提取DNA，然后用KpnⅠ酶切鑒定發生了同源重組的克隆，選擇性擴增后提取DNA，再次用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，篩選T279打靶載體構建正確的克隆。見圖3。

圖3 構建正確的T279打靶載體

1.7電轉染ES細胞取小鼠129品系原代ES細胞，經傳代后用含質量分數10%FBS-DMEM和10 mg/L絲裂霉素C 37 ℃處理2～3 h。計數稀釋后鋪到用質量分數0.1%生物膠預處理過的10 cm培養皿上，制成飼養層細胞。經Trypsin/EDTA消化處理后用PBS重懸，調整細胞密度為1×107mL-1。取0.8 mL細胞懸液，加入25 μg線性化的打靶載體，在240 Ⅴ、500 μF條件下電轉染。將電轉染后的ES細胞轉到含有飼養層的培養皿中，24 h后換成篩選培養液(含G418 200 mg/L、更昔洛韋2.5 μmol/L)。篩選培養8～10 d后挑取細胞克隆于96孔板中，1 ∶3傳代，其中一板用于鑒定，另外兩板凍存。

1.8T279基因敲除ES細胞的鑒定提取抗性篩選后的細胞基因組DNA，PCR法擴增5’端及3’端同源臂，初步篩選發生了同源重組的ES細胞。選擇性擴增培養初步篩選陽性的細胞克隆，提取基因組DNA后，EcoRⅤ酶切消化用于Southern blot 5’端鑒定，KpnⅠ酶切消化用于Southern blot 3’端鑒定。酶切反應體系：80 μL 基因組DNA，10 μL 10×H(10×L)Buffer，10 μLEcoRⅤ(KpnⅠ)，37 ℃水浴8 h。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(40 V、8 h)，用虹吸轉移法將產物轉移到Zeta-probe blot膜上。65 ℃預雜交3 h，雜交12 h，洗膜3次，每次15 min，最后-80 ℃X線片曝光72 h，洗片。

2 結果

2.1PL253-T279小載體的構建引物T279-1F、T279-1R和T279-2F、T279-2R PCR均擴增出特異Retrieving同源臂，條帶大小與預期一致，長度分別為455 bp和570 bp，測序結果與預期一致。Retrieving同源臂和PL253質粒大片段的連接產物電轉染到EL350菌后，涂板、提取DNA，KpnⅠ+NotⅠ酶切結果表明129 BAC質粒與PL253同源臂載體發生了正確的同源重組，PL253-T279小載體構建成功。見圖4。

M：Marke；1～6酶切結果

2.2T279打靶載體的鑒定loxp-neo-loxp片段電轉染到含PL253小載體的EL350菌之后，取電轉染后的菌液涂板、培養，提取DNA，KpnⅠ酶切結果表明有兩個同源重組陽性克隆存在，分別編為1號、2號。擴增這兩個克隆，提取DNA后，再次用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，結果見圖5。BamHⅠ酶切T279打靶載體后產生3條陽性條帶分別為11 516、3 801、1 067 bp；EcoRⅠ酶切T279打靶載體后產生3條陽性條帶分別為8 813、5 507、2 264 bp。上述酶切條帶大小與預期結果一致，說明T279打靶載體構建成功。

1、2：BamHⅠ酶切結果；3、4：EcoRⅠ酶切結果

2.3小鼠T279基因敲除ES細胞的鑒定經G418/更昔洛韋正負篩選的ES細胞克隆經PCR擴增5’端和3’同源臂，初步篩選得到1個同源重組陽克隆，編號10H(圖6，PC代表陽性對照、129代表陰性對照)。擴增培養10H號克隆，提取基因組DNA，分別進行5’端 和3’端Southern blot鑒定(圖7)。在5’端的鑒定中，10H號克隆在7.5 kb和5.9 kb位置均有一條帶，陰性對照僅在7.5 kb處有一條帶；在3’端的鑒定中，10H號克隆在17.6 kb和7.5 kb位置均有一條帶，陰性對照僅在17.6 kb處有一條帶。從上述Southern blot結果可知10H號克隆為同源重組的小鼠T279基因敲除ES細胞。

圖6 5’端和3’同源臂PCR初步篩選ES細胞同源重組陽性克隆

圖7 ES細胞基因組DNA Southern blot 鑒定

3 討論

基因敲除技術是目前從整體水平研究特定基因功能的主流技術。從20世紀90年代至今，國內外學者利用基因敲除技術建立了許多目的基因缺失動物模型，為生物醫學的發展做出了巨大的貢獻。近年來發展起來的大腸桿菌同源重組系統和129品系BAC文庫末端測序的完成使得基因敲除技術突破了傳統上打靶載體構建時受基因組DNA上限制性內切酶位點限制的局限，使得打靶載體構建變得高效、省時、靈活。

我們實驗室在構建T279打靶載體的過程中兼顧了以下幾個方面的問題：① 同源臂長度的選擇。前人的研究[6]表明打靶載體同源臂的長度對打靶效率的影響很大，一般認為同源重組效率與同源臂的長度成正比[7-8]，但是PCR擴增長片段序列容易引入突變。我們本次打靶載體的構建在大腸桿菌同源重組系統內進行，最終打靶載體5’ 端同源臂長4.3 kb, 3’ 端同源臂長5.0 kb，從而保證了同源重組的效率。②同源臂序列的正確性。經PCR方法得到Retrieving同源臂，經酶切驗證和測序，確認同源臂序列準確無誤。 ③T279打靶載體的正確性。T279打靶載體構建出來后首先用KpnⅠ酶切，初步篩選到兩個同源重組陽性克隆，擴增培養這兩個克隆，提取基因組DNA后，再次用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切驗證，確保所篩選到的同源重組陽性克隆準確無誤。④129 BAC質粒與ES細胞的同源性。Retrieving同源臂是以129 BAC質粒為模板通過PCR擴增得到的，后期電轉染所用的ES細胞也來自于小鼠129品系，同源臂與靶基因同源提高了同源重組發生的頻率。

T279在無精癥患者睪丸中的表達減少或消失[5]，我們推測T279與哺乳動物的精子發生過程密切相關。精子發生是大量睪丸特異性基因按時空順序表達，并與睪丸組織內外環境共同作用的結果。CERM[9]、Hlt[10]、tesmin[11]、Cdc2[12]、hDmcl[13]等皆被證明為睪丸特異性基因并在精子發生過程中起重要作用。這些基因參與了小鼠精子發生過程中的染色質包裝、染色質調控[14]、精子尾巴形成、能量代謝、頂體形成、透明帶結合和信號傳導[15]等。分析這些基因的組織表達特點、探討其特殊功能，將有助于明確這些基因在精子發生過程中的作用，為生精障礙患者尋找新的生物治療靶點。該研究中我們成功構建了T279基因敲除打靶載體，為T279基因敲除小鼠模型的建立奠定了基礎，對于研究T279基因的生理特性和功能，理解精子發生的內在機制、防治由精子異常引起的不育及研制男性避孕藥等具有重要意義。