三氧化二砷聯合環孢霉素A治療再生障礙性貧血的療效分析

曾軍杰, 劉麗娜 ,房佰俊

1)河南省醫學會 鄭州 450003 2)河南省腫瘤醫院血液科 鄭州 450008

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)的特點是全血細胞減少及骨髓造血功能衰竭，重型患者起病急且病情發展迅速，若未能及時有效治療，患者常常死于出血或感染[1]。當前，臨床上多以免疫抑制劑治療為主，但有效率僅40%左右。研究[2-3]顯示AA患者最顯著的病理特征是骨髓脂肪化，在體外給予適當濃度的三氧化二砷(ATO)，能夠明顯抑制健康成年人骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)成脂分化的潛能，從而改變AA患者骨髓造血微環境。該研究旨在探討ATO聯合環胞霉素A (cyclosporine，CsA)治療AA的臨床療效及相關機制,為治療AA探索新方法。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集河南省腫瘤醫院2012年4月至2017年5月收治的54例AA患者作為研究對象，均經由臨床癥狀與體征、實驗室細胞形態學分析與骨髓病理學確診，所有研究對象均屬慢性AA。其中，初診AA患者22例，接受過ATG治療者10例，口服CsA軟膠囊與司坦唑醇片治療者18例，經造血干細胞移植治療后復發者4例。患者分為2組。試驗組27例，其中男18例，女9例，年齡17～56(32.3±12.1)歲；對照組27例，其中男16例，女11例，年齡19～55(33.2±12.1)歲。兩組患者一般資料均衡。遵循知情同意原則，試驗組接受ATO聯合CsA治療，對照組接受單CsA治療，2組同時給予常規司坦唑醇片治療。

1.2治療方法

1.2.1 ATO 用量為0.15 mg/(kg·d)。在避光條件下，每d靜脈注射1次，每次用時不少于4 h，連續靜注5 d后間隔2 d，依照此法連用8周，全部療程時間不超17周。

1.2.2 CsA 用量為5 mg/(kg·d)，每d 2次口服。定時檢測血漿中藥物水平，進行劑量調整，保持血漿中CsA濃度在150～250 μg/L，連續服用至治療結束。

1.2.3 司坦唑醇片 用量為4～12 mg/d，每d 3次口服，用藥時間不低于4～6個月。

1.3療效評價以顯著血液學反應或研究對象不再需要輸注紅細胞和血小板為治療主要終點。部分緩解為不需輸注血制品，其血小板計數(PLT)> 30×109L-1，中性粒細胞絕對計數(ANC)>0.5×109L-1，血紅蛋白(HGB)>80 g/L。完全緩解為ANC>1.0×109L-1，HGB>100 g/L，PLT>100×109L-1；無緩解為對輸血存在依賴性，仍符合慢性AA標準。完全緩解和部分緩解率為有效。

1.4細胞學檢測

1.4.1 骨髓MSC成脂分化的變化 治療前從患者骨髓中分離出MSC。將傳至第4代的MSC以2×106/cm2密度接種于預先置有蓋玻片的6孔板內制備細胞爬片，加入DMEM完全培養液，置培養箱中，隔天換液1次。待細胞完全融合后，調細胞的終濃度為2×106mL-1，實驗組加入終濃度為0.001 mmol/L ATO和2.5 mmol/L CsA的成脂誘導體系培養基，對照組加入終濃度為2.5 mmol/L CsA的成脂誘導體系培養基，每3 d半量換液1次，共培養20 d。油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察各組細胞脂肪分化程度。

1.4.2 骨髓MSC成骨分化的變化 按照1.4.1的方法分離、培養骨髓MSC，并進行分組。實驗組加入終濃度為0.001 mmol/L ATO和2.5 mmol/L CsA的成骨誘導體系培養基，對照組加入2.5 mmol/L CsA的成骨誘導體系培養基，每3 d半量換液1次，共培養20 d。倒置顯微鏡下觀察各組細胞成骨細胞分化程度，并進行成骨染色，檢測細胞分化情況。用Von Kossa染色檢測鈣化基質沉淀情況。

1.5統計學處理采用SPSS 22.0分析。2組患者治療效果的比較采用Mannn Whitney U進行分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組患者療效比較試驗組治療有效率高于對照組，結果見表1。

表1 2組患者療效比較 例(%)

Z=-5.085，P<0.001

2.2細胞學觀察結果

2.2.1 骨髓MSC成脂誘導分化情況 實驗組細胞培養48 h后，大多數仍為梭形，呈纖維樣生長，細胞內無脂肪滴形成，只有少數細胞分化成卵圓形或圓形，細胞質中見少量脂肪滴，無脂肪泡形成(圖1A)。對照組細胞培養48 h后，部分細胞胞質內可以觀察到脂肪滴，含脂肪滴的細胞數量有明顯增多趨勢，同時伴有體積增大，脂肪泡融合形成(圖1B)。

A:實驗組;B:對照組

2.2.2 骨髓MSC成骨誘導分化情況 實驗組骨髓MSC培養72 h后，即可發現有少量鈣鹽沉積；7 d后，發現鈣鹽沉積程度明顯增加，14 d后可以發現有大量鈣鹽沉積(圖2A)；對照組骨髓MSC培養7 d后仍未觀察到有明顯鈣鹽沉積；14 d后鈣鹽沉積仍不是很明顯(圖2B)。

A:實驗組;B:對照組

3 討論

AA是因各種有害因素使骨髓造血組織減少、骨髓造血功能減低或衰竭，從而致使全血細胞減少的惡性血液系統疾病[4]，具有病程短、發展快的特點。近年來，以ATG或ALG為基礎的免疫抑制療法及造血干細胞移植技術已顯著改善了AA愈后情況，但AA治療仍面臨諸多困境。HSCT是當前最有可能根治慢性AA的治療手段之一，但供體極少，且治療費用高昂；在接受免疫抑制療法的AA患者中，也只有不足70%的患者骨髓造血功能得到不同程度恢復。

有研究[3]報道，在體外健康成人骨髓MSC成脂分化潛能可被ATO抑制，而成骨分化潛能可被上調。這說明ATO極有可能通過調控與糾正骨髓MSC向脂肪細胞和骨細胞分化的程度，調節骨髓造血的微環境。結合AA病因及可能的發病機制，推測當使用CsA調節AA患者免疫的時候，ATO尚有很大可能在患者體內通過對骨髓的造血異常微環境進行改善，從而發揮其促進AA患者造血恢復的功效。

作者在前期研究[5-6]結果的基礎上，對AA患者的ATO治療進行分析，結果發現ATO聯合CsA可抑制AA患者骨髓MSC向脂肪細胞分化，增強患者骨髓MSC向骨細胞分化的作用，但并未發現單用CsA對AA患者骨髓MSC有明顯抑制成脂分化和成誘導骨分化的作用。以上研究結果與相關文獻[7]報道相吻合。

該研究結果顯示，ATO聯合CsA治療AA臨床有效率為100.0%，高于對照組的40.7%。綜上作者推測，ATO可能通過抑制AA患者的骨髓細胞脂肪分化，誘導細胞向成骨分化，加速形成骨髓微環境中造血干細胞的“龕位”；增加造血干細胞數的錨定數量，促進AA患者造血功能的恢復，以達到治療AA目的。

總之,該研究提示ATO聯合CsA或許可以成為AA患者的治療方案之一。由于作者在臨床應用研究中隨訪時間較短，樣本量仍存在不足的問題，是故今后研究中仍需擴大樣本量，延長隨訪時間，以進一步驗證ATO治療AA的療效及安全性。