小鼠TSC21基因敲除打靶載體的構建和胚胎干細胞同源重組克隆的鑒定

殷正偉，王朝亮，張天標，楊 超，張衛星

鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科 鄭州 450052

男性不育已成為世界范圍的生殖難題[1]。不育癥的發生與睪丸特異性基因密切相關[2-4]。TSC21[5]是鄭州大學泌尿外科重點實驗室首次鑒定出的一個睪丸特異性表達新基因，前期研究[5]證實TSC21基因在人和小鼠體內均呈現睪丸特異性和年齡依賴性表達模式，免疫組化結果證實，TSC21蛋白主要在人精母細胞和圓形精子細胞中表達，且在隱睪癥患者和無精子癥患者睪丸組織中的表達水平明顯下降。為從整體水平探討TSC21基因在男性精子發生及男性不育癥中的作用和相關機制，鄭州大學泌尿外科重點實驗室構建了小鼠TSC21基因敲除打靶載體，為進一步建立TSC21基因敲除小鼠模型奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 質粒和菌株 129細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)質粒(編號：bMQ-158P8)訂購于基因服務公司；PL253、PL452質粒由美國國立癌癥研究所惠贈；DH5α、EL350大腸桿菌由鄭州大學泌尿外科重點實驗室保存。

1.1.2 129小鼠胚胎干細胞(ES細胞) 129品系小鼠ES細胞由鄭州大學泌尿外科重點實驗室保存。

1.1.3 PCR引物和Southern blot探針引物 根據129 BAC質粒序列分析結果，結合小鼠TSC21基因序列 (GenBank登錄號：AK005862)，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計6對引物。引物由南京金絲瑞生物科技有限公司合成。MⅠ-f，5’-ATTTGCGGCCGCGCCACAGTGTCTCACATAGA-3’；MⅠ-r，5’-CCCAAGCTTTGAGCAACACACCCTAGATA-3’；用來擴增Retrieving-5’同源臂，并分別引入酶切位點NotⅠ和HindⅢ。MⅡ-f，5’-CCAAGCTTAGATA TTGTAAATATTTCCTTTC-3’；MⅡ-r，5’-GGATCCGC GGGTACTTTAGGAAGATAAAC-3’；用來擴增Ret rieving-3’同源臂，并分別引入酶切位點HindⅢ和BamHⅠ。Loxpl-f，5’-ACGGGTCGACTTAGCATTC AGGAGG-3’；Loxpl-r，5’-CCGGAATTCGGTTTAGAA CAGGAT-3’；用來擴增Retrieving-5’同源臂，并分別引入酶切位點SalⅠ和EcoRⅠ。Loxpr-f，5’-CGCG GATCCTATAGAATGTATGTAG-3’；Loxpr-r，5’-ATAA GAATGCGGCCGCGTGAAATCCACTTCTAGTC-3’；用來擴增Retrieving-3’同源臂，并分別引入酶切位點BamHⅠ和NotⅠ。BamHⅠ-f，5’-TATGTTGAAG CATACTAGAGATGG-3’；BamHⅠ-r，5’-TACACGTTC AGAGACAACCT-3’；用來擴增5’端Southern blot 探針。SacⅠ-f，5’-CTTTAAGTGAGAGAGAATCTG-3’；SacⅠ-r，5’-TTAGACTCACACCTAACCTAA-3’；用來擴增3’端Southern blot探針。

1.1.4 工具酶、試劑盒及其他試劑 限制性核酸內切酶(NotⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ、SacⅠ、EcoRⅠ等)、高保真擴增PCR用DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、堿性磷酸酶購自TaKaRa公司；氯霉素、卡那霉素、氨芐青霉素購自上海生工生物工程技術服務有限公司。拜厄斯賓PCR產物純化試劑盒、拜厄斯賓切膠回收試劑盒購自杭州博日科技有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物購自英國奧克西德公司。質粒中抽試劑盒購自Promega 公司。達爾伯克改良培養基、胎牛血清購自Gibco 公司。絲裂霉素C、遺傳霉素、更昔洛韋購自Sigma公司。磷酸鹽緩沖溶液、Southern blot轉膜液、預雜交液、雜交液、洗膜液由鄭州大學泌尿外科重點實驗室配制。Zeta探針印跡膜購自Bio-Rad公司。同位素α-P32-三磷酸脫氧胞苷購自 PerkinElmer公司。測序由南京金絲瑞生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1 基因敲除策略 小鼠TSC21基因定位于染色體6C3位點，包含4個外顯子，其cDNA長810 bp，開放閱讀框543 bp，編碼含180個氨基酸、相對分子質量為21 040的蛋白質。由于起始密碼子ATG位于外顯子2，所以決定敲除外顯子2～外顯子4。

1.2.2 PL253 retrieve小載體的構建 提取129 BAC質粒DNA，分別用2對引物MⅠ-f、MⅠ-r 和MⅡ-f、MⅡ-r PCR擴增Retrieving-5’及 Retrieving-3’ 同源臂。反應體系如下：NDA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL、dNTP 混合物(2.5 mol/L)4 μL、上游引物 (10 μmol/L) 1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、5×Prime STAR緩沖液(含Mg2+)10 μL、BAC DNA 1 μL、MilliQ水32.5 μL。PCR程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。上述PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定切膠回收后，用限制性核酸內切酶(NotⅠ+HindⅢ)酶切Retrieving-5’同源臂，用限制性核酸內切酶(HindⅢ+BamHⅠ)酶切Retrieving-3’同源臂。同時用限制性核酸內切酶(NotⅠ+BamHⅠ)酶切PL253質粒DNA并回收PL253大片段。將上述酶切回收后的Retrieving-5’、Retrieving-3’同源臂和PL253大片段用T4連接酶連接構建含左右Retrieve同源臂的PL253質粒。此連接產物經HindⅢ線性化后電轉到含129 BAC質粒的EL350菌中，在Retrieving-5’及Retrieving-3’同源臂的介導下129 BAC質粒將會和PL253連接產物發生同源重組。

1.2.3 PL452小載體的構建 以129 BAC質粒DNA為模板，分別用2對引物Loxpl-f、Loxpl-r和Loxpr-f、Loxpr-r PCR擴增Retrieving-5’及Retrieving-3’同源臂。反應體系同1.2.2。 PCR程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PL452質粒DNA 和Retrieving-5’同源臂切膠回收產物經SalⅠ+EcoRⅠ酶切后用T4連接酶連接，將連接產物轉化到DH5α感受態細胞、培養、提取質粒DNA后用SalⅠ+EcoRⅠ酶切鑒定連接產物。以同樣的方法將Retrieving-3’同源臂連入已經連接Retrieving-5’同源臂的PL452質粒，用NotⅠ+BamHⅠ酶切鑒定連接產物。

1.2.4 TSC21打靶載體的構建 PL452小載體經NotⅠ+SalⅠ+ScaⅠ線性化后，電轉到含PL253小載體的EL350菌里，在Retrieving-5’及Retrieving-3’ 同源臂的介導下PL253小載體將會和PL452小載體發生同源重組，將電轉后的菌液接種到氨芐青霉素+卡那霉素LB平板、培養、提取質粒DNA后用EcoRⅠ酶切鑒定發生了同源重組的EL350菌克隆，選擇性擴增經EcoRⅠ酶切鑒定同源重組陽性的EL350菌克隆，提取質粒DNA后再次用BglⅡ、KpnⅠ和SacⅡ酶切鑒定。

1.2.5 ES細胞電轉染 取129小鼠ES細胞，傳代后用體積分數10%胎牛血清-DMEM和0.01 μg/L絲裂霉素C 37 ℃處理2～3 h。計數稀釋后鋪到用體積分數0.1% gelatin 預處理的10 cm培養皿上，制成飼養層細胞。擴增后的129 ES細胞經Trypsin/EDTA消化處理后用磷酸鹽緩沖溶液重懸至細胞密度為1×107mL-1的單細胞狀態。取0.8 mL的細胞懸液，加入25 μg線性化的PL253打靶載體質粒DNA，240 V 500 μF電轉，電轉后的ES細胞轉到含有飼養層細胞的培養皿中，24 h后換成ES細胞篩選培養液(含遺傳霉素200 mg/L、更昔洛韋2.5 μmol/L)。電轉染8～10 d后挑ES細胞克隆于96孔板中，擴增后1 ∶3傳代，其中1板用于提取基因組DNA，另外2板凍存。

1.2.6 ES細胞基因組PCR鑒定及Southern blot鑒定 將上述遺傳霉素/更昔洛韋抗性的ES細胞克隆擴增后提取基因組DNA，然后用PCR方法擴增5’端同源臂(TSC21-ES-f，5’-GATCATGTTTTCAGTATGTTGAAGCA-3’；TSC21-ES-r，5’-AAGGGTTATTGAATATGATCGGA-3’)，初步篩選發生了同源重組的ES細胞。在此基礎上，選擇性擴增經PCR鑒定同源重組陽性的ES細胞克隆，提取基因組DNA后，BamHⅠ酶切消化用于Southern blot 5’端鑒定，SacⅠ酶切消化用于Southern blot 3’端鑒定。5’端雜交探針為擴增的541 bp片段，3’端雜交探針為擴增的700 bp片段。酶切反應體系：80 μL ES細胞基因組DNA，10 μL緩沖液，10 μLBamHⅠ(SacⅠ)，37 ℃水浴8 h。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，40 V 8 h，用虹吸轉移法將DNA轉移到Zeta-probe blot膜上。65 ℃預雜交3 h，雜交12 h，洗膜3次，每次15 min，最后-80 ℃ X光片曝光72 h，洗片。

2 結果

2.1PL253retrieve小載體的構建引物MⅠ-f、MⅠ-r 和MⅡ-f、MⅡ-r PCR均擴增出特異Retrieving同源臂，大小與預期一致，均為600 bp，且測序結果與預期一致。Retrieving同源臂和PL253質粒大片段的連接產物電轉到含129 BAC質粒的EL350菌后，涂板、提取質粒DNA，酶切結果表明129 BAC質粒與PL253同源臂載體發生了正確的同源重組，酶切后產生3條條帶，分別為7 214、6 676、4 223 bp，與預期結果吻合(7 214和 6 676 bp條帶相距太近，瓊脂糖凝膠電泳難以區分)。見圖1。

M：DNA Marker；1～6：重組后PL253 retrieve小載體

2.2PL452小載體的構建引物Loxpl-f、Loxpl-r和Loxpr-f、Loxpr-r PCR均擴增出特異Retrieving同源臂，大小與預期一致，分別為538和563 bp，且測序結果與預期一致。PL452質粒連接Retrieving-5’和Retrieving-3’同源臂之后其連接產物轉化到DH5α感受態細胞，培養、提取質粒DNA后酶切結果表明PL452小載體構建成功，酶切后產生2條條帶，分別為4 986和563 bp，與預期結果吻合。見圖2。

M：DNA Marker；1、2、4、5：構建失敗的PL452小載體；3：構建成功的PL452小載體

圖2PL452小載體酶切鑒定結果

2.3TSC21打靶載體的構建PL452小載體電轉到含PL253小載體的EL350菌里后，取電轉后的菌液涂板、培養、提取質粒DNA，酶切結果表明有2個同源重組陽性克隆存在。選擇性擴增培養這2個克隆，提取質粒DNA后，再次進行酶切鑒定，結果顯示酶切條帶大小與預期一致，TSC21打靶載體構建成功。見圖3。

1、2：BglⅡ酶切產物(9 669、4 082、1 457 bp)；3、4：KonⅠ酶切產物(7 214、4 223、3 717 bp)，4 223和 3 717 bp條帶相距太近，瓊脂糖凝膠電泳難以區分；5、6：SacⅠ酶切產物(7 801、4 130、3 223 bp);M:DNA Marker

圖3TSC21打靶載體酶切鑒定結果

2.4ES細胞基因組PCR鑒定及Southernblot鑒定挑取經遺傳霉素/更昔洛韋正負篩選的ES細胞克隆96個于96孔板中，擴增培養后提取基因組DNA，PCR擴增5’端同源臂初步篩選得到5個同源重組陽性ES細胞克隆。擴增培養這5個ES細胞克隆，提取基因組DNA，分別進行5’端 和3’端Southern blot鑒定。在5’端的鑒定中，1H、4G、5C、5H 4個克隆在27 800和8 000 bp位置均有1個條帶，129陰性對照僅在27 800 bp處有1個條帶；在3’端的鑒定中， 1H、5C 2個克隆在12 000和7 200 bp位置均有1個條帶，129陰性對照僅在12 000 bp處有1個條帶。可知1H、5C 2個ES細胞克隆就是所需要的同源重組陽性ES細胞克隆。見圖4、5。

5H、1H、4G、3D、5C：分別為擴增同源臂篩選得到的5個同源重組陽性ES細胞克隆DNA；M：DNA Marker

圖4 5’同源臂PCR初步篩選ES細胞同源重組陽性克隆

129：陰性對照；5H、1H、4G、3D、5C：分別為擴增同源臂篩選得到的5個同源重組陽性ES細胞克隆DNA；M：DNA Marker

圖5ES細胞基因組DNASouthernblot鑒定結果

3 討論

基因敲除技術是目前從整體水平研究特定基因功能的主流技術。近年來發展起來的大腸桿菌同源重組系統和129品系BAC文庫末端測序的完成使得基因敲除技術突破了傳統上打靶載體構建時受基因組DNA上限制性內切酶位點強烈局限的限制，使打靶載體的構建變得高效、省時、靈活。

鄭州大學泌尿外科重點實驗室在構建TSC21打靶載體的過程中兼顧了以下幾個方面的問題：①同源臂長度的選擇。前人的研究[6]表明打靶載體同源臂的長度對打靶效率的影響很大，一般認為同源重組效率與同源臂的長度呈正比[7-8]，PCR擴增長片段序列容易引入突變，本次打靶載體構建在大腸桿菌同源重組系統內進行，最終打靶載體5’端同源臂長5 000 bp, 3’端同源臂長3 000 bp，從而保證同源重組的效率。②同源臂序列正確性的保證。經PCR方法得到2對同源臂之后，進行了酶切驗證和測序，確保同源臂序列準確無誤，保證同源重組的效率。③TSC21打靶載體正確性的驗證。TSC21打靶載體構建出來后首先用EcoRⅠ酶切，初步篩選到2個同源重組陽性克隆，選擇性擴增培養這2個克隆，提取質粒DNA后，再次用多種內切酶進行驗證，確保所篩選到的同源重組陽性克隆準確無誤。④129 BAC質粒與ES細胞的同源性。2對同源臂都是以129 BAC質粒為模板用PCR方法擴增得到的，后期電轉所用的ES細胞也來自于129小鼠品系，因此同源臂與靶基因同源，可以提高同源重組發生的頻率。

TSC21在隱睪癥患者和無精子癥患者睪丸組織中的表達水平明顯下降，作者推測TSC21與哺乳動物精子發生過程密切相關。精子發生是大量睪丸特異性基因、睪丸高表達基因按時空順序表達與睪丸組織內外環境共同作用的結果，例如Fank1[9]、Ccdc136[10]、Zmym3[11]、Zfp318[12]、Cdh2[13]等皆被證明為睪丸特異性基因并在精子發生過程中起重要作用。這些基因參與了小鼠精子發生過程中的染色質包裝、染色質調控[14]、精子尾巴形成、能量代謝、頂體形成、透明帶結合和信號傳導[15]等。分析這些基因的組織表達特點、探討其特殊功能，將有助于明確這些基因在精子發生過程中的作用，為生精障礙患者尋找新的生物治療靶點。鄭州大學泌尿外科重點實驗室有鑒于此構建了TSC21基因敲除打靶載體，為TSC21基因敲除小鼠模型的建立及進一步的研究奠定了基礎。