VEGF、MMP-9在卵巢癌組織中的表達及貝伐單抗聯合順鉑對卵巢癌細胞SKOV3的作用

劉 端，李紅雨，臧星卉，魚志琪，孫 瑋，李玉光

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052

卵巢癌是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，早期病變不易發現，晚期缺乏有效的治療手段，致死率位居婦科惡性腫瘤之首[1]。目前主要采用以手術為主的綜合治療，包括放療和化療等，但5 a生存率僅為20%～25%[1]。隨著對卵巢癌發生發展分子生物學機制的研究，新的治療靶點不斷出現。其中，血管靶向治療是目前熱點之一，尤其是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)單克隆抗體貝伐單抗[2]，其次與侵襲相關的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族也受到了極大的關注[3]。本文旨在了解卵巢癌組織中VEGF、MMP-9的表達情況以及貝伐單抗聯合順鉑對卵巢癌細胞的作用機制，為卵巢癌的臨床治療提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1研究對象選擇2015年9月至2017年6月在鄭州大學第三附屬醫院婦科住院并經病理檢查確診的101例患者。其中：上皮性卵巢惡性腫瘤患者41例(卵巢癌組)，年齡28～75歲，中位年齡47歲，術前未接受放化療；卵巢良性腫瘤患者30例(卵巢良性腫瘤組)，年齡20～72歲，中位年齡45歲；因良性子宮病變行卵巢切除的患者30例(對照組)，年齡50～70歲，中位年齡55歲。卵巢癌組、卵巢良性腫瘤組與對照組年齡比較，差異無統計學意義。

1.2主要試劑免疫組化試劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；貝伐單抗購于瑞士羅氏公司；順鉑購于齊魯制藥有限公司；兔抗人VEGF、MMP-9、AKT、Bad單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠/兔IgG抗體購于美國CST公司；Western blot化學發光液購于美國Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物技術研究所。

1.3 3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白表達的檢測采用免疫組化法檢測3種組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達情況。將制備好的石蠟組織切片置于二甲苯中脫蠟，再經乙醇梯度水化后，放于枸櫞酸鈉抗原修復液中加熱，用體積分數為3%過氧化氫孵育，滅活內源性過氧化氫酶。然后滴加體積分數為10%山羊血清封閉30 min，加入鼠源抗VEGF、MMP-9一抗過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min。滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制反應時間，當陽性部位出現特異性顯色而背景無著色時，終止顯色。然后用蘇木素進行復染，鹽酸乙醇分化液分化，藍化液藍化，梯度無水乙醇逐級脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，在400倍光學顯微鏡下選取5個視野拍照。免疫組化結果判定標準如下。按著色強度評分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；按陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞<25%為1分，25%～為2分，50%～為3分，75%～為4分。結果取2項評分的乘積，0～1分為蛋白陰性表達，≥2分為蛋白陽性表達。

1.4細胞及培養人卵巢癌細胞系SKOV3由第四軍醫大學病原生物學教研室趙亞教授惠贈。細胞在含有體積分數為10%胎牛血清(美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素(碧云天公司)的RPMI 1640培養液中培養，細胞密度達到80%～90%時，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化并傳代。

1.5細胞活性檢測取對數生長期的卵巢癌細胞SKOV3，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化并計數，按照2 000個/孔的密度接種于96孔板中，在37 ℃、體積分數為5% CO2中培養24 h后，將2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L的貝伐單抗加入到96孔板中，每個濃度設置6個平行孔，同時設置無藥物處理組及無細胞空白對照組，藥物作用48 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)放于37 ℃恒溫箱中繼續孵育4 h。然后棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液,用酶標儀檢測570 nm處的吸光度(A)值。存活率=(加藥組A值-空白對照組A值)/(無藥物處理組A值-空白對照組A值)×100%，并計算IC50。

1.6細胞凋亡率檢測采用Annexin V-FITC和PI雙染法結合流式細胞術檢測貝伐單抗單獨及聯合順鉑對SKOV3細胞的凋亡誘導作用。將對數生長期的SKOV3細胞以每孔3×105個細胞的密度接種至6孔板中，置于恒溫箱中孵育24 h之后分別加入相應的藥物(貝伐單抗5 mg/L、順鉑3 mg/L、貝伐單抗5 mg/L+順鉑3 mg/L)，對照組加入等體積的PBS，48 h后收集細胞，用PBS洗滌2～3遍。根據細胞凋亡檢測試劑盒說明書，每管加入500 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。于冰浴中用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7MMP-9及VEGF信號通路中關鍵蛋白AKT和Bad蛋白表達的檢測采用Western blot法。貝伐單抗5 mg/L、順鉑3 mg/L單獨及聯合使用處理SKOV3細胞48 h，提取細胞中的總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒定量，取30 μg蛋白，配制體積分數5%濃縮膠、體積分數15%分離膠進行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白電轉至PVDF膜上。經過封閉(體積分數為5% BSA室溫封閉2 h)、與一抗孵育(11 000稀釋，4 ℃孵育過夜)、洗滌(TBST洗滌3次，每次10 min)、與二抗孵育(14 000稀釋，室溫孵育1 h)、洗滌(TBST洗滌3次，每次10 min)后，在膜上覆蓋適量化學發光顯色液并置于Amersham Imager 600凝膠成像系統中成像、拍照。

1.8統計學處理采用SPSS 19.0進行統計學分析。3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白陽性表達率的比較采用χ2檢驗；卵巢癌組織中VEGF、 MMP-9蛋白表達的關系采用Pearson相關進行分析；貝伐單抗單獨及聯合順鉑使用時卵巢癌細胞SKOV3凋亡率的比較采用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同類型卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達與對照組、卵巢良性腫瘤組比較，卵巢癌組VEGF、MMP-9蛋白陽性表達率升高(圖1、表1)。卵巢癌組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達呈正相關(表2)。

A:正常卵巢組織；B：卵巢良性腫瘤組織；C:卵巢癌組織；1：VEGF蛋白；2：MMP-9蛋白圖1 3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達(SP,×400)

表1 3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白表達的比較

*：與卵巢癌組相比，P<0.001

表2 卵巢癌組織中VEGF、MMP-9蛋白表達相關性分析 例

χ2=6.034，P=0.014，rp=0.360

2.2貝伐單抗對卵巢癌細胞SKOV3的體外增殖抑制作用貝伐單抗對卵巢癌細胞SKOV3的增殖抑制作用隨著濃度的增加而增強，呈劑量依賴性(圖2)，IC50為(8.89±0.27) mg/L。

圖2 貝伐單抗對卵巢癌細胞SKOV3的體外增殖抑制作用

2.3 4組SKOV3細胞凋亡率的比較結果見表3。

表3 4組SKOV3細胞凋亡率的比較 %

F貝伐單抗=187.892，F順鉑=404.224，F交互=161.284，P均<0.001

2.4貝伐單抗聯合順鉑對MMP-9及VEGF信號通路中AKT、Bad蛋白表達的影響結果見圖3。

1～4：分別為對照組、貝伐單抗組、順鉑組、貝伐單抗+順鉑組

圖3貝伐單抗聯合順鉑對VEGF、MMP-9、p-AKT、AKT、Bad蛋白表達的影響

3 討論

VEGF在腫瘤的發生發展過程中促進新生血管的生成[4]，為腫瘤提供必需的氧氣和營養物質[5-7]。MMP-9能夠降解細胞外基質和基底膜，幫助腫瘤細胞進入血液循環，也可以支持腫瘤細胞外滲和轉移[8-9]，MMP-9與血管生成及腫瘤侵襲能力密切相關，這對腫瘤的生長和轉移起到非常重要的作用[10-12]。在本研究中作者發現，卵巢癌組織中VEGF、MMP-9蛋白的陽性表達率比卵巢良性腫瘤組及對照組高，且二者呈正相關，提示二者可能成為卵巢癌治療的聯合作用靶點。

貝伐單抗是重組的人源化單克隆抗體，主要與VEGF-A結合，抑制VEGF與其受體的結合，從而抑制腫瘤血管的生成[13]。目前，FDA已批準貝伐單抗用于轉移性結直腸癌、轉移性乳腺癌、晚期非小細胞肺癌的一線治療。除此之外,貝伐單抗在肝癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤的應用也取得較好的臨床療效，尤其是和化療藥物聯合使用時[14-16]。研究[17-18]發現，貝伐單抗在單獨使用時隨著其濃度的遞增，U87膠質瘤細胞所分泌的MMPs逐漸增多，增強了細胞的遷移和侵襲能力。在動物實驗[17]中，相比貝伐單抗的短期治療，其長期治療使腫瘤細胞表現出更強的遷移和侵襲能力。在本研究中Western blot結果顯示，貝伐單抗單獨作用于SKOV3細胞時并未減弱與侵襲相關的MMP-9蛋白的表達，但也沒有表現出增強的趨勢，貝伐單抗長期作用于卵巢癌細胞之后，MMP-9蛋白的表達水平是否有增加，還有待進一步的研究。另外，有學者[17]通過貝伐單抗和MMP抑制劑的聯合干預，成功降低了膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力。在本實驗中作者采用貝伐單抗聯合順鉑對卵巢癌細胞進行處理，凋亡結果顯示，貝伐單抗的單獨使用并未引起細胞的明顯凋亡，順鉑單獨使用時引起細胞的凋亡率也僅有13 %左右，但是兩者聯合使用后細胞的凋亡率明顯增加，說明二者的聯合使用在誘導卵巢癌細胞凋亡方面起到了良好的協同效應。同時Western blot結果也證實，貝伐單抗和順鉑單獨處理組與對照組相比促凋亡蛋白Bad的表達增強，在聯合用藥組中Bad表達增強更明顯。接下來作者對VEGF下游信號通路中的關鍵蛋白AKT進行了檢測，結果顯示，貝伐單抗單獨作用于卵巢癌細胞時可減弱AKT的磷酸化水平，這說明貝伐單抗抑制了VEGF與其受體的結合，并抑制了下游信號通路的傳導，在聯合用藥組中效果更加明顯。Bad是一種促凋亡蛋白，其過表達可促進細胞凋亡。Western blot結果顯示，貝伐單抗單獨使用組可增強凋亡蛋白Bad的表達，與順鉑聯合使用后效果更明顯，而此時更值得注意的是MMP-9蛋白的表達有了明顯的減弱。由此作者推斷，貝伐單抗聯合順鉑可協同抑制VEGF下游信號通路的傳導，進而影響MMP-9蛋白的表達。這充分說明貝伐單抗的單獨使用雖可影響VEGF下游信號通路的傳導，進而誘導細胞凋亡，但并不能減弱細胞的侵襲能力，而和化療藥物順鉑的聯合使用可減弱MMP-9蛋白的表達水平。因此，貝伐單抗聯合順鉑有可能成為治療卵巢癌的一種有效方案。