桃小食心蟲成蟲GOBPs與PBPs的基因克隆及 表達譜分析

田志強, 孫麗娜, 李艷艷, 張懷江, 閆文濤, 岳 強, 仇貴生

(中國農業科學院果樹研究所, 興城 125100)

桃小食心蟲CarposinasasakiiMatsumura隸屬鱗翅目Lepidoptera,蛀果蛾科Carposinidae,為害多種果樹,包括蘋果、桃、山楂、梨、棗等[1]。由于其具有分布廣、隱蔽性強、世代重疊、自然天敵少等特點,一度被美國、智利、南非、俄羅斯等多個國家列為檢疫性害蟲[2]。桃小食心蟲鉆蛀時間短,幼蟲蛀果為害時間長,使得在化學防治時容易錯過最佳防治時間而常常需要多次重復噴藥,致使事倍功半,同時還對環境造成不良影響。果實套袋雖可以起到較好的防治效果,但是棗、山楂等不便于套袋,并且隨著勞動力費用日益增高和“無袋化栽培技術”政策的提出,桃小食心蟲的為害有逐年加重的趨勢[3]。近年來,引誘劑與驅避劑的開發為害蟲防治提供了新的思路與策略。自1997年以來,研究發現桃小食心蟲性信息素主要成分是順-7-二十烯-11-酮和順-7-十九烯-11-酮,但不同地區使用兩種性信息素分子的比例存在顯著差異,分別為150∶1,90∶10,20∶1等[4-5]。另外,在田間誘芯使用中兩者發揮最佳效果的比例也不盡相同[6]。因此加強對桃小食心蟲嗅覺系統的研究將會為桃小食心蟲的防治與監控奠定理論基礎。

研究表明,昆蟲之所以具有尋找寄主、繁殖等能力,主要依靠其觸角淋巴液中的氣味結合蛋白(odorant binding protein,OBPs)[7-9]。通常昆蟲腦部觸角葉由兩個平行亞系統組成,一個主要負責處理寄主植物氣味分子,而另一個特化為專門處理種內或相似種之間的性信息素分子[10]。因此,OBP根據其功能主要分為普通氣味結合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs)和性信息素結合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)[11]。PBPs主要存在于觸角的毛形感器,并能夠專一性地識別性信息素分子[12-13];GOBPs中GOBP1存在于毛形感器和錐形感器中,而GOBP2僅存在于錐形感器中,兩者主要識別普通氣味分子[14-15]。在功能領域,近年的研究表明,有些昆蟲的GOBPs也可以與性信息素分子發生結合,甚至結合力高于PBPs[16];另外,PBPs也可以與植物揮發物等氣味分子發生不同程度的結合[17-18]。

本研究在桃小食心蟲觸角轉錄組的基礎上,利用RACE技術克隆GOBPs和PBPs基因,使用生物信息學方法對序列進行分析,并通過qPCR方法分別檢測5個基因在雌雄成蟲不同組織中的表達情況。本試驗為進一步研究其在桃小食心蟲氣味識別的分子機制中的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

于2015年7月在果樹研究所(40.61°N,120.73°E)蘋果園采集帶有淚滴為害狀的‘金冠’蘋果。隨后以未成熟的‘金冠’蘋果在溫度為(25±1)℃、相對濕度70%±5%、光周期為L∥D=15 h∥9 h的養蟲室飼養獲得桃小食心蟲種群[19]。

1.2 總RNA提取,GOBPs和PBPs全長基因克隆

分別取桃小食心蟲成蟲的頭、胸、腹、足、翅和觸角組織各50 mg,放入盛有1 mL RNAiso Reagent試劑且無RNA酶的1.5 mL離心管中,利用組織破碎機勻漿后參照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA。最后用RNase-free水溶解,在檢測其濃度與純度后,采用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒的方法將RNA反轉錄合成cDNA第一鏈,于-20℃保存備用。

GOBPs與PBPs cDNA全長序列擴增:根據桃小食心蟲觸角轉錄組數據(GFQL00000000)與NCBI庫中的基因序列的BLAST結果,利用生物信息學分析,獲得桃小食心蟲2個GOBP和3個PBP的基因序列片段。根據5個基因片段序列并兼顧3′-RACE和5′-RACE至少重復200 bp的條件下,使用Premier 5.0分別設計3′-RACE和5′-RACE的Outer Primer和Inner Primer引物(表1)。利用Outer Primer和Inner Primer配對進行套式PCR反應,按照TaKaRa RACE試劑盒進行反轉錄和PCR擴增該基因3′和5′-末端cDNA序列。RACE Mix體系:PCR-Grade H2O 15.5 μL,2×Ex Seq Amp Buffer 25 μL,Seq Amp DNA Polymerase 1 μL;RACE反應體系:UMP(Universal Primer Mix)2 μL,cDNA 1 μL,引物各0.5 μL,Mix 16.6 μL。反應條件:98℃1 min;94℃ 30 s,62℃ 30 s,72℃ 1 min,35個循環;72℃ 10 min。將獲得的目的片段切膠純化,與pMD19-T載體連接后轉化至DH5α感受態細胞,篩選陽性克隆測序后進行拼接可獲得目的基因全長cDNA序列。

1.3 桃小食心蟲成蟲GOBPs與PBPs基因的生物信息學分析

將克隆得到的5個基因的全長序列進行生物信息學分析,利用在線軟件ORF Finder (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定其開放閱讀框(open reading frame,ORF),并翻譯為氨基酸序列,運用ExPASy服務器中的Compute pI/MW程序對蛋白質分子量與等電點進行預測。采用在線軟件Signa1P 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測。通過NCBI中的BLASTx程序搜索鱗翅目其他昆蟲的OBP家族序列,分析它們的序列一致性;最后使用MEGA6.0軟件進行CsasGOBPs和CsasPBPs與其他昆蟲OBPs的系統發育進化樹的構建,方法采用鄰接法(neighbor-joining),并將結果進行1 000次bootstrap重復抽樣分析。

1.4 桃小食心蟲成蟲GOBPs與PBPs基因的組織表達譜

以桃小食心蟲觸角轉錄組中的β-actin為內參基因,采用Primer Premier 5.0軟件設計各目的基因與內參基因的定量引物(表1),使用TaKaRa公司的熒光定量試劑盒定量分析GOBPs與PBPs在桃小食心蟲雌雄成蟲不同組織間的表達水平。以1.2節中獲得的cDNA為模板,無菌水為陰性對照,在定量PCR儀(CFX96 Real-Time Syste,BioRad)中進行熒光定量PCR。每個樣品3次重復,反應體系為25 μL:2×SYBR Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5 μL,10 μmol/L正反向引物各0.4 μL,200 ng/μL cDNA 1 μL,ddH2O 10.7 μL。反應程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,72℃ 20 s,40個循環。反應結束后,根據各目的基因及內參基因Ct值,利用2-ΔΔCt相對定量法統計CsasGOBPs和CsasPBPs基因在成蟲不同組織的表達量差異。

表1基因克隆與熒光定量所用引物

Table1PrimersforgenecloningandqRT-PCR

名稱Name序列Sequence (5'-3')用途Purpose3'F-GOBP1-OGAAGCAGGTGTCGTTAGTTTTGGG3'R-GOBP1-IGCTGTCGCTACTGGTCCCACTAA5'F-GOBP1-OAGTGGTCCTCCTCAGCCTCGTTCT5'R-GOBP1TGAACTGTTGTCAGCATTATCGTGG3'F-GOBP2-OCAGTGAAAGGTGATGCGGTCCAGA3'R-GOBP2-ICTGCTTGCTTCAAACGAGATGCTAA5'F-GOBP2ACTTCTCCATCACCGCCTCAATCA5'R-GOBP2TCACTACTCGGTCGCAGTCATCAAC3'F-PBP1GCTGCTGCTTTGGATAAGTGTA3'R-PBP1AGGAATTTGGGTGCGTGGTTAT5'F-PBP1CTCAATCAGTGTCTCCATGTTCGG5'R-PBP1CGCATTCGTGGATCATGGTCACTA3'F-PBP2AGTGTCGGTGGTGGTTGCTCTA3'R-PBP2TTCTGGAAGGAGGGGTATGAG5'F-PBP2CAGCCAATATCTCTCCGATGACCA5'R-PBP2GTTAGGGATGGAGTTTTCACAGCC3'F-PBP3TAAACGCTGTCTCCTTGTCGGT3'R-PBP3CTTCTGGAAAGAGGAGTACGAGC5'F-PBP3CTTCAGTGACAAGCACGTCCATCT5'R-PBP3GAGACACTGGTCCTCCAATGCTTC擴增全長Primersfor genecloneF-GOBP1CGACACTTCAACCTGCTCACGGR-GOBP1CAGGACTCGGCGACAACAAACTCF-GOBP2GATGCGGTCCAGAGTGAGAGR-GOBP2CACCATCTTTGGGGACAGCF-PBP1TTGGGTGCGTGGTTATGTGCR-PBP1TCAATCAGTGTCTCCATGTTCGF-PBP2TCTGGAAGGAGGGGTATGAGCR-PBP2GACGCCATCTTTGAAGCAGCF-PBP3GTAAGCAAGGAGGTCGGATGR-PBP3CCATCTTCGGTGTCCAGTCGF-ActinGTGTTATGGTGTCTAGTTGGTR-ActinGATGTTCAGTTCTGTCTGGTAT熒光定量PrimersforqRT-PCR

2 結果與分析

2.1 GOBPs與PBPs基因的克隆與序列分析

本研究獲得了桃小食心蟲GOBP1、GOBP2、PBP1、PBP2和PBP3的cDNA全長序列,提交至NCBI數據庫,登錄號分別為:MG256559、MG256560、MG256556、MG256557和MG256558。5個基因的cDNA全長序列分別為617、811、755、795和561 bp,開放閱讀框長度分別為504、492、507、492和498 bp,各基因去除信號肽后所編碼的氨基酸序列特征如表2所示。桃小食心蟲GOBP1與GOBP2的3′端非編碼區長均為40 bp左右,5′端非編碼區分別為74 bp和279 bp;在PBPs中,PBP3的5′端非編碼區僅有14 bp,3′端非編碼區長49 bp;而PBP1和PBP 2的5′端與3′端非編碼區序列相對較長,5′端序列長度分別為73 bp和51 bp,3′端序列長度分別為340 bp和252 bp。桃小食心蟲GOBPs和PBPs的特點均符合昆蟲OBP基因家族的序列特征,通過結構模型“C1-X15-39-C2-X3-C3-X21-44-C4-X7-12-C5-X8-C6”(X代表相鄰兩個半胱氨酸之間的氨基酸殘基數目)鑒定發現桃小食心蟲5個氣味結合蛋白均具有保守的6個半胱氨酸[20-21]。

2.2 CsasGOBPs和CsasPBPs的進化樹構建與多重序列分析

桃小食心蟲的CsasGOBPs和CsasPBPs的系統進化關系分析結果發現桃小食心蟲與其他鱗翅目昆蟲的GOBPs和PBPs這幾個亞家族分成5大類,分別為GOBP1、GOBP2、PBP1、PBP2和PBP3。從進化樹中可以看出PBP2和PBP3兩個亞族的親緣關系較近,它們所在的分支與PBP1亞家族所構的單系群平行;然而,相較于PBP亞家族,GOBP1和GOBP2雖然也與其他鱗翅目昆蟲的GOBPs形成不同的分支,但是與它們的親緣關系較遠,這與它們之間所具有序列一致性較低的結果相符。

將GOBPs與PBPs序列在NCBI中采用BLASTx進行比對發現,桃小食心蟲的GOBPs與小卷葉蛾科的GOBPs一致性較高,其中CsasGOBP1與大豆食心蟲的LglyGOBP1一致性最高(72%),而CsasGOBP2與蘋果蠹蛾CpomGOBP2的一致性最高(78%);在PBPs的BLASTN結果中CsasPBP1與煙芽夜蛾的HvirPBP1一致性最高(85%),CsasPBP2與麥蛾的ScerPBP一致性最高(71%),CsasPBP3與甜菜夜蛾的SexiPBP3一致性最高(69%)。將用于構建進化樹的氨基酸序列進行多重序列比對發現,它們除了具有保守的6個半胱氨酸外,在其他位置的氨基酸也具有高度的一致性,例如甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、纈氨酸(V)等一些疏水性氨基酸(圖2)。

表2CsasGOBPs與CsasPBPs的序列分析1)

Table2SequenceanalysisofCsasGOBPsandCsasPBPs

基因Gene全長/bpFull length開放閱讀框/bpORF氨基酸長度AA length信號肽(AA)SP蛋白分子量/KDaMW等電點PIGOBP16175041682416.604.85GOBP28114921642116.344.92PBP17555071692616.505.41PBP27954921642115.764.91PBP35614981661816.664.93

1) ORF:開放閱讀框; SP: 信號肽; MW: 相對分子量; PI: 理論等電點。

ORF: Open reading frame;SP: Signal peptide; MW: Molecular weight; pI: Isoelectric point.

圖1 桃小食心蟲GOBPs和PBPs與其他鱗翅目昆蟲相關蛋白的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the GOBPs and PBPs from Carposina sasakii and other lepidopteran insects

圖2 CsasGOBPs和CsasPBPs與其他鱗翅昆蟲相關基因的氨基酸序列相似性比較Fig.2 Alignment of amino acid sequences of CsasGOBPs and CsasPBPs with those from other insects

2.3 桃小食心蟲成蟲GOBPs與PBPs在不同部位的表達譜分析

本研究以桃小食心蟲的β-actin為內參基因,采用qPCR技術調查了CsasGOBPs和CsasPBPs基因在桃小食心蟲雌雄成蟲頭、胸、腹、足、翅和觸角中的相對表達量。結果表明這5個基因都在雄蟲觸角中顯著表達;在PBPs中尤其PBP2在雄蟲觸角中表達量更高,約為雌蟲觸角的600倍;另外,結果還顯示這5個基因在雌雄成蟲的翅和腹部有不同程度的表達(圖3)。

圖3 CsasGOBPs和CsasPBPs在桃小食心蟲雌雄成蟲不同部位的表達譜Fig.3 Relative expressions of CsasGOBPs and CsasPBPs in different parts of female and male Carposina sasakii

3 討論

OBPs在昆蟲識別并結合寄主及自身所釋放的氣味分子的嗅覺感受過程發揮著關鍵作用;一般認為是PBPs識別并結合性信息素分子后,將其運輸至嗅覺受體,指導昆蟲的求偶行為。本研究以實驗室已有的桃小食心蟲觸角轉錄組測序數據為基礎,利用基因功能注釋等方法篩選出這5個基因的序列片段,并通過RACE技術克隆得到5個基因的全長序列。利用生物信息學對這5個基因的信號肽、等電點和蛋白分子量等的分析表明這5個基因均具有OBPs家族的典型特征,即由120～160個氨基酸組成的酸性、水溶性的多肽分子,N端具有20個氨基酸構成信號肽序列。在對這5個基因蛋白序列的親脂性分析中發現它們都有較為明顯的疏水區域,同時,序列多重比對結果也表明不同種昆蟲之間的PBPs與GOBPs在多個疏水性氨基酸位點高度保守,而氣味分子多數為疏水性分子,這可能意味著它們在與配體分子結合的過程中發揮著關鍵作用,因此可能為結合的關鍵位點[22]。從已鑒定PBPs基因的昆蟲中發現,不同昆蟲中所具有的PBPs數目不同,例如家蠶只存在1種PBP,小地老虎存在3種PBPs,而亞洲玉米螟有PBP4和PBP5的存在[23-25];而不同昆蟲中的性信息素分子的組成數也不盡相同,這可能表明不同的PBPs用于識別不同的性信息素分子。

現在越來越多的研究表明不僅PBPs可以與性信息素分子發生特異性結合,類似的GOBPs也可以與之相結合,甚至結合力更強于PBPs;例如在甜菜夜蛾的研究中發現SexiGOBP2相較于SexiPBP1對性信息素分子的結合能力更強[18]。同時系統進化樹構建結果表明,GOBPs中GOBP1與PBPs所形成的單系群的親緣關系更近,而與GOBP2所構成的分支距離較遠;另外,在與其他鱗翅目昆蟲的GOBPs與PBPs進行多重序列比對時發現它們之間的序列一致性能達到50%以上,有研究表明家蠶的BmorPBPs與BmorGOBPs亞家族基因簇中的基因很相似,因此,他們很有可能來自同一祖先基因的復制,后來在環境變化時由自然選擇壓而分化成不同的基因型[26-27]。

起初學者們認為PBPs在雄性昆蟲的觸角中特異性表達,但后來的研究在雌蟲觸角中也檢測到了PBPs表達[13,22],本試驗結果發現,CsasGOBPs與CsasPBPs在雌蟲觸角中也有表達;另有研究表明雌蟲觸角中的嗅覺感器存在大量PBPs,因此推斷雌蟲可能通過檢測自身所釋放的性信息素濃度,以此來辨別附近是否有同種同性個體的存在,進而避免同種之間的競爭;而有趣的是雄蟲也可以釋放信息素來增加雌雄昆蟲的交配成功率,當雄蛾接近雌蛾后,便開始釋放雄性信息素來抑制雌蛾釋放雌性信息素,從而避免其他同種雄蛾求偶行為的發生[25]。此外,越來越多的研究證明GOBPs也可以與性信息素分子結合,在本研究中發現CsasGOBPs在桃小食心蟲雄蟲觸角中顯著高于雌蟲觸角中,而昆蟲基因的表達模式在一定程度上可以反映其功能,而這種性別差異性表達可能表明它們在桃小食心蟲性信息素分子的識別中也存在差異。

觸角在昆蟲的嗅覺識別機制中發揮著極為關鍵的作用,而多數嗅覺相關蛋白基因也在觸角中特異性或高量表達。在小地老虎PBP1-3研究中發現,小地老虎的3個PBPs除了在觸角中顯著性表達外,在一些非嗅覺器官中也有表達,例如喙、唇須、頭、胸、腹等部位也有低量的表達[13]。在本試驗的組織表達譜中同樣也檢測到這5個基因在足、翅等組織中表達,這種現象可能與雌蛾尋找寄主產卵場所有關。當雌蛾產卵時其性信息素也隨之分泌,而當同種雌蟲在同一寄主的同一部位產卵時,能敏銳地接收到此性信息素信號并轉移至新的寄主,最終避免后代之間的食物競爭以有利于后代的繁衍[28]。

綜上所述,本研究獲得了桃小食心蟲CsasGOBPs和CsasPBPs,為進一步研究桃小食心蟲GOBPs和PBPs與性信息素分子及寄主揮發物氣味分子之間的結合機制及研發驅避或者引誘技術奠定基礎。