誘導小麥抗葉銹病生防細菌的篩選、鑒定 及其防效評價

徐 爽, 陳立杰, 王媛媛, 朱曉峰, 劉曉宇, 范海燕, 段玉璽

(沈陽農業大學植物保護學院, 沈陽 110866)

小麥葉銹病由Pucciniatriticina引起,是世界小麥生產上的主要病害之一,發生嚴重時可使小麥減產40%以上[1]。在我國主要麥區曾發生4次中度以上的小麥葉銹病大暴發,給小麥生產帶來嚴重的產量損失[2-3]。近年來該病害在我國呈現擴大發展的趨勢,2012 年在甘肅、河南、陜西、安徽和四川等地小麥葉銹病大面積發生[4],2015年和2016年黃淮麥區小麥葉銹病也較往年發生提前了近一個月[5]。

小麥葉銹病的防治方法多以選用抗病品種和化學防治為主[6]。化學殺菌劑的使用易使病原菌產生抗藥性,污染環境,危害生態平衡[7]。而具有防效好、無毒性、無污染等特點的生物防治也成為學者們的研究熱點[8]。利用生防菌防治小麥條銹病已有報道。Pang等[9]和Li等[10]研究表明惡臭假單胞菌Pseudomonasputida和枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis均可抑制銹菌的夏孢子侵染,并誘導小麥抗條銹病。但對小麥葉銹病的生物防治報道卻不多[11]。因此,利用生防菌誘導防控小麥葉銹病具有十分重要的意義。

生防菌可誘導植物產生誘導抗病性,進而起到防治病害的作用。利用植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)誘導植物防控植物病害在國內外已被廣泛報道,Chowdappa等[12]用枯草芽胞桿菌B.subtilis和哈茨木霉Trichodermaharzianum誘導番茄對晚疫病產生抗性;Yoshioka等[13]用棘孢木霉T.asperellum誘導水稻對細菌性葉斑病產生抗性。芽胞桿菌作為重要的生防因子,利用其誘導植物產生抗病性的研究也有很多。項鵬等[14]發現簡單芽胞桿菌B.simplexSneb545可誘導大豆抑制大豆孢囊線蟲Heteroderaglycines的入侵;Niu等[15]發現蠟樣芽胞桿菌B.cereus可誘導番茄產生防御反應,抵抗灰霉菌Botrytiscinerea的侵染。

本研究通過大田初步篩選試驗獲得3株抗小麥葉銹病的生防細菌,室內測定其促生作用和防治效果,獲得最優菌株Sneb1462,進一步對Sneb1462菌株進行鑒定和田間防效試驗驗證,探討其作為生防菌株防治小麥葉銹病的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

3株細菌菌株Sneb1197、Sneb1289、Sneb1462經過大田篩選獲得,由沈陽農業大學北方線蟲研究所提供。小麥品種‘新春20’和病原菌葉銹菌P.triticina由沈陽農業大學植物免疫研究所李天亞老師提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌發酵液制備

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(NA):酵母浸膏 1 g,蛋白胨 5 g,牛肉浸膏3 g,蔗糖 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 6.8～7.0。

將供試的3株細菌菌株接種在NA培養基上進行純培養,28℃下培養3 d。將純化的細菌菌株接種于裝有NA液體培養基的三角瓶,置于恒溫振動培養箱中(28℃,165 r/min)搖瓶發酵3 d。將菌懸液用無菌水稀釋至1.0×108cfu/mL備用。

1.2.2 小麥種子處理

小麥種子用75%乙醇表面消毒30 s,無菌水沖洗 5次[9]。將50 g小麥種子與1 mL菌懸液混勻進行種子處理,以空白培養基處理為對照。

1.2.3 細菌菌株對小麥種子萌發的影響

在培養皿中放入無菌濾紙,無菌水潤濕,分別將20粒經細菌菌懸液包衣的小麥種子均勻分布于培養皿(d=10 cm)中。以空白培養基包衣為對照。共4組處理,每個處理5次重復。恒溫培養箱中(25℃,相對濕度100%)培養,2 d時觀察記錄發芽率,測量其芽長與根長。

發芽率=(發芽種子數/供試種子總數)× 100%。

1.2.4 細菌菌株對小麥苗期生長的作用

將滅菌的土壤(V土∶V沙=1∶1)混勻,裝入規格為21 cm×21 cm塑料花盆中。將細菌菌懸液處理后的小麥種子播種于花盆中,每盆20粒。以空白培養基處理為對照,共4組處理,每個處理5 次重復。在日光溫室中正常培養30 d 時,每個處理隨機選取10株小麥植株,保持根系完整,用自來水將植株根部泥土沖洗干凈,吸水紙吸干,測量單株小麥的株高、地上部分以及地下部分鮮重。

1.2.5 細菌菌株對小麥葉銹病的盆栽防效試驗

分別將濃度為1.0×108cfu/mL的3株細菌菌懸液處理后的小麥種子播種于塑料花盆中,每盆20粒小麥種子,以空白培養基處理為對照,共4組處理,每個處理5次重復,在日光溫室中正常培養。待小麥長至一葉一心期,每盆留下15株長勢一致的小麥植株,進行小麥葉銹菌P.triticina噴霧接種,菌懸液濃度為1.0×105孢子/mL,接種量每盆10 mL,黑暗保濕12 h以上。接種后10 d,每個處理隨機調查20株發病情況,并計算其發病率和嚴重度。病害嚴重度參照李振岐等[2]的方法,依據病葉上銹菌夏孢子堆所占據的面積與葉片總面積的百分比來確定病級,用分級法表示,設1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%八級,其他百分比值分級歸于各自在上述分級值區間的最大值那一級,葉片未發病,記為“0”。調查時目測估計每片調查葉片的發病嚴重度,計算公式如下:

平均嚴重度=∑(各嚴重度級別×各級病葉數)/調查葉片總數;

發病率=(發病的葉片數/調查的葉片總數)× 100%。

1.2.6 細菌Sneb1462對小麥葉銹病的田間防效試驗

田間小區設計:以邊長2 m的正方形區域為一個處理小區,每個小區含5壟。每壟播種10 g經菌株Sneb1462處理的小麥種子,以空白培養基處理為對照,共2組處理,每個處理設3次重復,小區周圍設保護行。30 d時, 每個處理的各個重復小區均隨機選取10株苗,測量其株高,并進行葉銹菌接種,接種后10 d調查病害嚴重度(方法同上)。在成熟期時,每個處理隨機選取30株小麥植株,測量穗長、穗重。

1.2.7 細菌Sneb1462的鑒定

形態特征觀測:在NA培養基上觀察菌落形態及其培養性狀,參考東秀珠等[16]所描述的方法進行革蘭氏染色、芽胞染色,透射電子顯微鏡(JEM100CX-Ⅱ)下觀察鞭毛著生方式。

16S rDNA測序:采用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根)提取本試驗細菌的基因組DNA。通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌的16S rDNA序列。PCR產物凝膠電泳純化進行測序(金唯智)。測序結果經BLAST系統序列比對分析,利用MEGA 6 軟件構建系統進化樹。

生理生化特征反應:參照東秀珠等[16]的方法進行檢測。

1.3 數據統計分析

本研究中所有數據均采用SPSS 20.0軟件進行統計分析,室內盆栽試驗結果采用Duncan氏方差分析,田間試驗結果采用配對樣本t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 細菌菌株對小麥種子萌發的影響

為獲得促生抗病優良的菌株,本試驗采用Sneb1197、Sneb1289和Sneb1462細菌菌株菌懸液處理小麥種子,測定它們對種子萌發的影響。結果(表1)表明,3個菌株都對小麥種子萌發具有促進作用。Sneb1462菌株促生效果尤為顯著,小麥發芽率達99%,顯著高于空白對照,其芽長和根長均與空白對照差異顯著,分別提高了13.8%和9.3%。

表1不同菌株浸種處理對小麥種子萌發的影響1)

Table1Effectsofsoakingseedswithdifferentstrainsonthegerminationofwheatseeds

處理Treatment發芽率/%Budding rate芽長/cmBud length根長/cmRoot lengthSneb1197(97.00±4.47)a(1.41±0.07)b(2.29±0.05)abSneb1289(99.00±2.24)a(1.47±0.10)ab(2.32±0.12)abSneb1462(99.00±2.24)a(1.57±0.11)a(2.47±0.10)aCK(93.00±5.70)b(1.38±0.05)b(2.26±0.04)b

1) 表中數據為平均值±標準差。同列數據后不同字母分別表示在0.05水平差異顯著(Duncan氏法)。下同。

Data in the table are mean±SD. Different letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level by Duncan’s test. The same below.

2.2 細菌菌株對小麥苗期生長的作用

溫室條件下測定了不同菌株發酵液對小麥苗期生長的促生作用(表2)。結果表明,3株菌株菌懸液處理的小麥植株株高和地上部鮮重與對照相比無顯著差異。但細菌Sneb1462菌懸液處理的小麥根長和地下部鮮重與空白對照差異顯著,分別提高了30.19%和29.03%,說明細菌Sneb1462菌懸液促進了小麥苗期根部的生長(圖1)。

表2不同菌株浸種處理對小麥苗期生長的作用

Table2Effectsofsoakingseedswithdifferentstrainsonthegrowthofwheatseedlings

處理Treatment株高/cmHeight根長/cmRoot length地上部鮮重/gAbove-ground fresh weight地下部鮮重/gFresh root weightSneb1197(19.63±0.95)a(19.07±1.31)ab(1.42±0.15)a(0.79±0.09)abSneb1289(18.29±0.79)a(18.07±1.13)bc(1.37±0.27)a(0.82±0.05)aSneb1462(19.66±0.33)a(20.74±1.03)a(1.46±0.15)a(0.80±0.02)aCK(17.00±1.17)a(15.93±0.63)c(1.25±0.11)a(0.62±0.04)b

圖1 Sneb1462促進小麥根部生長Fig.1 Wheat root growth promoted by strain Sneb1462

2.3 細菌菌株對小麥葉銹病的盆栽防效

盆栽防效試驗結果表明,Sneb1197、Sneb1289和Sneb1462菌懸液處理的小麥植株的葉銹病發病率(圖2 a)和嚴重度(圖2 b)均顯著低于空白對照。其中菌株Sneb1462處理對小麥葉銹病防治效果最好(圖3),發病率為53.82%,嚴重度為10.27%,分別比對照處理降低27.54%和49.90%,說明菌株Sneb1462菌懸液能誘導小麥產生抗性,減少葉銹病菌的侵染。

圖2 不同菌株浸種處理對小麥葉銹病發病率(a)和嚴重度(b)的影響Fig.2 Effects of soaking seeds with different strains on the incidence (a) and severity (b) of wheat leaf rust

2.4 細菌Sneb1462對小麥葉銹病的田間防效

依據室內盆栽試驗結果,獲得一株最優細菌菌株Sneb1462進行田間防效驗證試驗。結果顯示在田間葉銹病發病程度上,菌株Sneb1462菌懸液處理的病害嚴重度為26.26%,與空白對照相比,降低了38.60%(圖4)。菌株Sneb1462菌懸液處理的小麥植株的株高和穗重也顯著高于對照,分別提高16.44%和34.98%(表3)。穗長與對照相比差異不顯著。

圖3 盆栽試驗Sneb1462對小麥葉銹病的防治效果Fig.3 Control effects of the strain Sneb1462 on wheat leaf rust in pot experiments

圖4 Sneb1462浸種處理對小麥葉銹病田間防治效果Fig.4 Control efficacy of wheat seeds soaked with Sneb1462 on wheat leaf rust in the field

圖5 Sneb1462對小麥葉銹病的田間防治效果Fig.5 Control effects of strain Sneb1462 on wheat leaf rust in field experiments

處理Treatment株高/cmHeight穗長/cmSpike length穗重/gSpike weight千粒重/gTKWSneb1462(34.77±2.23)*(9.76±0.51)(2.74±0.09)*(46.43±0.87)CK(29.86±3.66)(8.84±0.55)(2.03±0.22)(45.13±1.93)

1) 表中數據為平均值±標準差。*表示經配對樣本t檢驗在P<0.05水平差異顯著。

Data in the table are mean±SD. *:Indicates significant difference atP<0.05 level by paired samplesttest.

2.5 細菌Sneb1462的鑒定

經盆栽試驗和田間防效試驗,篩選出一株促生效果及對葉銹病防效優良的細菌菌株Sneb1462。在NA培養基上Sneb1462菌落表面光滑,呈乳白色,有黏性(圖6a)。菌體為桿狀,單個或排列分布,大小為(1.2～2.3)μm×(0.3～0.7)μm。芽胞呈橢圓形,胞囊膨大,中生到端生。革蘭氏染色為陽性,透射電鏡放大2.5×103倍觀察,鞭毛為周生(圖6b)。

圖6 菌株Sneb1462的菌落(a)及其鞭毛(b)的透射電鏡形態Fig.6 The shapes of colonies of strain Sneb1462 (a) and its flagellum (b) under transmission electron microscope

PCR擴增產物經測序后獲得菌株Sneb1462 16S rDNA部分序列(MG132172)。通過MEGA 6軟件構建系統發育分析結果顯示,其DNA序列與多黏類芽胞桿菌P.polymyxa相似度達100%,在系統發育樹中也與其屬于同一分支(圖7)。

圖7 基于16S rDNA序列構建的部分類芽胞桿菌屬Paenibacillus spp.的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of some Paenibacillus spp.based on 16S rDNA sequences

菌株Sneb1462生理生化特征顯示(表4),Sneb1462可以利用葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、蔗糖、甘油等作為碳源;其硝酸還原反應、V-P反應、水解淀粉、接觸酶等反應均為陽性,檸檬酸鹽利用、H2S產生、氧化酶等反應為陰性;在耐鹽性方面,該菌株不能在含鹽5%、10%培養基上生長。而且鑒定結果與東秀珠等[16]描述的多黏類芽胞桿菌P.polymyxa的生理生化特征一致,綜合16S rDNA序列分析和生理生化鑒定結果,將菌株Sneb1462鑒定為多黏類芽胞桿菌P.polymyxa。

表4菌株Sneb1462的生理生化測定

Table4PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainSneb1462

特征 CharacterSneb1462特征 CharacterSneb1462葡萄糖 Glucose+V-P 反應V-P test+D-木糖 D-Xylose+水解淀粉 Starch hydrolysis+L-阿拉伯糖 L-Arabinose+氧化酶 Oxidase-蔗糖 Sucrose+接觸酶 Catalase+乳糖 Lactose+厭氧生長 Anaerobic growth+甘油 Glycerol+耐鹽性 NaCl tolerance甘露醇 Mannitol+ 1% NaCl+檸檬酸鹽利用 Utilization of citrate- 2% NaCl+H2S產生 H2S production- 5% NaCl-硝酸還原反應 Deoxidize nitrate+ 10% NaCl-

3 討論

本研究采用透射電鏡觀察、16S rDNA序列分析及生理生化反應特征等方法,將Sneb1462菌株鑒定為多黏類芽胞桿菌P.polymyxa。室內防效試驗結果表明,經多黏類芽胞桿菌Sneb1462處理的小麥,其葉銹病的發病率和嚴重度與對照相比降低27.54%和49.90%;田間試驗顯示,其病害嚴重度降低了38.60%,并對小麥促生增產都具有顯著效果。田間試驗葉銹病的嚴重度低于室內試驗,可能是由于田間環境復雜,溫濕度、土壤pH、含水量等不同生態條件以及微生物區系等因素均對其有影響[14]。

在以往關于生防菌的研究中,多采用以生防菌菌懸液灌根或葉片涂抹噴施的方法進行篩選和防效評價試驗[17-19]。在本研究中,通過多黏類芽胞桿菌Sneb1462對小麥種子進行處理,發現也能誘導小麥對葉銹病產生抗性。因此,利用有益微生物進行種子處理防控病害將是一種新型的植保措施,具有重要的研究意義。

植物根際促生菌(PGPR)是可以參與植物的固氮和溶磷反應,產生及調節植物體內激素水平,促進植物的生長發育,直接或間接對病原物產生抑制作用[9, 20],增加農作物產量的有益微生物,其作為重要的生物防治資源不容忽視。植物根際促生菌的研究主要集中于芽胞桿菌屬和假單胞菌屬細菌,其中多黏類芽胞桿菌就是一種重要的植物病害生防菌和根際促生菌[21]。

多黏類芽胞桿菌誘導植物抗病性的研究已有報道。Du等[22]研究發現多黏類芽胞桿菌NSY50菌懸液灌根處理可以誘導黃瓜抗枯萎病,并顯著提高黃瓜的生物量;Ryu等[23]報道通過包埋處理將多黏類芽胞桿菌E681定殖于芝麻根部,可以誘導其對猝倒病產生抗性,并促進芝麻生長。此外,童蘊慧等[24]報道采用多黏類芽胞桿菌W3菌懸液及其濾液進行葉片涂抹處理可以誘導番茄產生系統抗性,增強番茄植物對灰霉病菌侵染的抵抗力,并能提高番茄產量。本研究中發現,在溫室和田間條件下,采用多黏類芽胞桿菌Sneb1462進行種子處理可誘導小麥產生對葉銹病菌的抗性,顯著降低其嚴重度,同時也對小麥的促生增產有顯著作用。

Liu和Kim等[25-26]已測定了多黏類芽胞桿菌全基因組序列,幾個具有生防促生功能的相關基因被發現。上述針對多黏類芽胞桿菌生物防治的研究多采用葉面涂抹噴施或灌根處理的方法,種子處理卻很少見報道。本研究中,多黏芽胞桿菌Sneb1462誘導小麥抗葉銹病及促生增產作用機理尚不明確,還有待進一步研究。