海南省溫郁金炭疽病的病原鑒定

馬 瑞, 徐 剛, 鄭 樊, 鄭妃慶, 謝昌平

(海南大學熱帶農林學院,熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室, 海口 570228)

溫郁金CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling作為我國應用最廣的藥用植物之一,已有1 000多年的種植歷史,屬姜科姜黃屬草本植物,原產于浙江瑞安,是著名的“浙八味”之一[1]。其根莖中揮發油和姜黃素類化合物含量高,有效成分可以預防和治療癌癥,除此之外,在保肝、抗氧化、抗炎癥等方面也有著良好的效果[2]。

近年來,海南省開始引進種植溫郁金,隨著栽培面積的不斷擴大,病害也日益突出,尤其是新發現的炭疽病蔓延迅速,其主要危害溫郁金的葉片,產生褐色的病斑,造成葉片卷縮和枯死,重病區發病率達到90%以上,嚴重影響了溫郁金的產量和藥理品質,造成了巨大的經濟損失,準確鑒定病原種類對了解病害流行規律及有效控制病害發展非常重要。

目前國內外已報道的溫郁金病害有白絹病[3]、根腐病[4]、枯萎病[5]、葉斑病[6]和葉枯病[7-10],本試驗于海南省的溫郁金種植基地采集炭疽病葉片,通過對病原菌的分離純化、形態觀察、致病性測定以及多基因序列分析,最終確定其病原菌,以期為該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源:于2016年9月在海南省海口市、澄邁縣和臨高縣的溫郁金種植基地采集具有典型發病癥狀的溫郁金炭疽病葉標本。

試劑:真菌總DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?Fungal DNA Mini Kit,美國OMEGA Biotek公司;2 × MasterMix,北京博邁德生物技術有限公司;2000 marker,北京博邁德生物技術有限公司;引物,北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司。

儀器:BX51研究系統顯微鏡,日本奧林巴斯株式會社;G1000基因擴增儀,杭州博日科技有限公司;600+電泳儀,北京君意東方電泳設備有限公司;WD-9413B凝膠成像分析儀,北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用組織分離法分離病原菌[11],取發病典型的病葉,在病健交界處切取大小為5 mm×5 mm的組織塊,先用75%乙醇浸數秒后,再用0.1%升汞表面消毒1～2 min,然后用無菌水沖洗3次,將其轉移到PDA平板上,于28℃恒溫培養箱中光照培養。待菌種產孢后,采用瓊脂平板稀釋純化法[12]進行純化,將純化的菌株轉入試管斜面保存。

1.2.2 柯赫氏法則驗證

選取長勢一致的健康溫郁金植株,用75%乙醇對葉片進行表面消毒后,用無菌水沖洗干凈,用滅菌針刺傷葉片,切取直徑5 mm的菌餅接種在葉片傷口處,每個葉片貼接4個菌餅,并外加浸有無菌水的紙巾保濕,再用噴濕的保鮮袋套住,置于自然環境下培養,以接種PDA培養基作為空白對照。每處理5次重復,共接種10株。每天觀察發病情況,對發病葉片進行病原菌的重分離。

1.2.3 病原菌形態特征的觀察

將直徑為5 mm的菌餅接種到PDA平板中央,置于28℃恒溫光照培養箱內培養。每天觀察菌絲的生長情況及菌落形態,培養10 d后,挑取培養物在顯微鏡下觀察分生孢子盤及分生孢子,記錄其形態特征并測量分生孢子大小。附著胞的誘發采用玻片萌發法[13],配制一定濃度(大約1×104個/mL)的孢子懸浮液,吸取少量滴在潔凈的載玻片上,保濕皿保濕置于28℃下培養,48 h后觀察附著胞的形態特征。

1.2.4 病原菌多基因分子鑒定

在純培養5 d后的病原菌菌落邊緣打孔,挑取適量菌餅轉接至100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)中,28℃下180 r/min振蕩培養5 d。將菌絲體用3層滅菌紗布過濾,去除液體培養基,并用滅菌水沖洗菌絲體2～3次,采用OMEGA試劑盒提取病原菌的基因組DNA。分別對病原菌的核糖體內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)、肌動蛋白基因(actin,ACT)、β-微管蛋白基因(β-tubulin,TUB2)、幾丁質合成酶A基因(chitin synthase A,CHS-1)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和組蛋白基因(histone3,HIS3)進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為50 μL,包括DNA模板2 μL,正反向引物各2 μL(10 μmol/L),2×MasterMix 25 μL,以ddH2O 補足至50 μL。反應程序為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,各引物按相應的退火溫度退火45 s(表1),72℃延伸1 min,共30個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得與預期大小一致的核苷酸片段后,送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司純化和測序。將測序獲得的6個基因序列提交GenBank數據庫,獲得序列號,并從GenBank數據庫中下載同時含有ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH和HIS3基因的炭疽屬模式菌株及其他菌株序列作為參考序列,將各菌株基因按照ITS-ACT-TUB2-CHS-1-GAPDH-HIS3的順序首尾拼接,用MEGA 7.0軟件的“W”功能比對并手工校正后,選擇鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹,以自展法(bootstrap)進行檢測,共循環1 000次。

2 結果與分析

2.1 田間病害癥狀

溫郁金炭疽病主要為害葉片,偶見為害葉鞘。田間發病多從中下層葉片開始(圖1a),發病初期葉片或葉鞘出現水漬狀的淡黃色橢圓形病斑(圖1b,c),隨后逐漸擴大為圓形、卵圓形或不規則形,邊緣深褐色,微具輪紋,中心灰白色至灰褐色,病斑外環繞黃色暈圈(圖1d,e)。病斑正面有許多輪生狀黑色小點,即病原菌的分生孢子盤(圖1f)。病斑可在葉片的任何部位發生,嚴重時多個病斑聯合成片,造成葉片卷縮和枯死。

表1擴增溫郁金炭疽病病原菌不同序列所用的引物

Table1Primersusedinthisstudy

基因Gene退火溫度/℃Annealing temperature引物Primer name引物序列(5'-3')Primer sequenceITS55ITS1ITS4TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGATATGCACT58ACT-512FACT-783RATGTGCAAGGCCGGTTTCGCTACGAGTCCTTCTGGCCCATTUB259T1βt2bAACATGCGTGAGATTGTAAGTACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGCCHS-159CHS-79FCHS-354RTGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAGTGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTGGAPDH59GDFGDRGCCGTCAACGACCCCTTCATTGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGTHIS355CYLH3FCYLH3RAGGTCCACTGGTGGCAAGAGCTGGATGTCCTTGGACTG

圖1 溫郁金炭疽病的田間癥狀和人工接種的癥狀Fig.1 Symptoms of Curcuma wenyujin anthracnose in the field and after artificial inoculation

2.2 病原菌的分離

從海南省海口市、澄邁縣和臨高縣的溫郁金種植基地采集具有典型發病癥狀的溫郁金葉片20片,通過病原菌的分離共得到6個顯微形態一致的疑似病原菌,將菌株分別進行編號并用于后續試驗。

2.3 柯赫氏法則驗證

將分離得到的6個菌株分別接種到健康的葉片上,7 d后針刺法接種的植株都出現了與田間自然發病一致的癥狀:葉片上病斑呈黃色水漬狀,漸變成近圓形,邊緣暗褐色,有明顯的黃色暈圈,后期病斑中心呈灰白色,內輪生許多小黑點(圖1g,h)。對這些病斑組織再次進行病原菌分離,獲得與原接種菌株形態特征一致的菌落和分生孢子,符合柯赫氏法則;而對照組植株均未發病(圖1i),也未分離到病原菌。由此確定,分離得到的菌株是引起溫郁金炭疽病的病原菌。

2.4 病原菌的形態特征

病原菌在PDA培養基上形成圓形、平坦、邊緣整齊的菌落,菌落初期為白色,氣生菌絲絨毛狀,2 d后可見菌落底部墨綠色小點(分生孢子盤),之后菌落逐漸由白色變為深橄欖綠色,15 d后菌落表面產生淡黃色至淺橙色的分生孢子堆(圖2 a, b)。載孢體盤狀,多聚生,黑色,頂端不規則開裂。剛毛散生于載孢體上,數量較多,暗褐色,頂端較尖,色淡,具有2～4個隔膜,基部平齊。分生孢子新月形,基部微鈍,頂端稍尖,無色,單胞,內部含有1個油球,大小為(21.6～28.8)μm×(3.0～5.7)μm(圖2c,d)。附著胞棒形或橢圓形,全緣褐色,極少數為不規則形,大小為(6.68～18.87)μm×(4.95～9.05)μm(圖2e,f)。病原菌形態特征與郁金炭疽菌Colletotrichumcurcumae(Syd.) E.J. Butler & Bisby形態特征基本一致[14-15]。

圖2 病原菌菌落、分生孢子及附著胞形態特征Fig.2 Morphology of the colony, conidium and appressorium of the pathogen

2.5 病原菌多基因系統發育分析

由于分離獲得的6個菌株在PDA培養基上的培養性狀和形態特征一致,因此,選取菌株TJ0709作為代表菌株進行分子鑒定。對病原菌TJ0709的ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH和HIS3基因進行擴增,分別得到542、265、740、275、290和380 bp的片段(圖3)。序列克隆測序后,與參考基因進行比對,系統發育樹顯示,病原菌TJ0709與郁金炭疽菌C.curcumae模式菌株(IMI 288937)聚為一個進化枝,并且支持率為100%(圖4)。結合病原菌形態特征和多基因系統發育樹,鑒定溫郁金炭疽病病原菌為郁金炭疽菌C.curcumae。

圖3 病原菌TJ0709菌株的PCR產物Fig.3 PCR products of the pathogen TJ0709 with six primer pairs

圖4 基于ITS、ACT、Tub2、CHS-1、GAPDH和HIS3 基因合并序列構建的溫郁金炭疽病菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Curcuma wenyujin anthracnose pathogen based on concatenated sequences of ITS, ACT, Tub2, CHS-1, GAPDH and HIS3 genes

3 討論

本研究通過對采自海南省海口市、澄邁縣和臨高縣的溫郁金炭疽病葉片進行病原菌的分離純化,將分離菌株進行室外活體接種可使溫郁金發病,回接病葉再分離,可得到與原分離菌形態特征一致的菌株,經柯赫氏法則驗證分離菌株即為溫郁金炭疽病的病原菌。通過對病原菌的形態觀察,發現其與郁金炭疽菌Colletotrichumcurcumae(Syd.) E.J. Butler & Bisby形態特征基本一致,對病原菌的ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH和HIS3基因進行聯合分析,系統發育樹結果顯示,病原菌與郁金炭疽菌C.curcumae模式菌株(IMI 288937)聚為一個進化枝,并且支持率為100%,其他分支中,同種菌株間也以非常高的支持率聚在一起,結合形態學特征和多基因系統分析結果鑒定溫郁金炭疽病的病原菌為郁金炭疽菌C.curcumae,與Li等[6]報道的廣西溫郁金葉斑病的病原一致,兩種病害癥狀相同,但鑒于病原菌為炭疽屬真菌,筆者認為將該病害稱為溫郁金炭疽病更為合適。郁金炭疽菌C.curcumae是一種比較特殊的炭疽菌,目前國內外對其報道較少,Palarpawar和Ghurde曾報道過其寄主有姜黃、尾桴草、百慕大、芋和茄屬植物[16],Damm等運用ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH和HIS3基因進行聯合分析,對形態上極難區分的草本植物上分離的炭疽菌屬真菌區分開來,并將郁金炭疽菌C.curcumae歸類為平頭炭疽菌復合種[15]。由郁金炭疽菌C.curcumae引起溫郁金炭疽病在海南尚屬首次發現。

溫郁金的主要葉部病害還有葉枯病,該病害與溫郁金炭疽病的不同在于發病位置主要集中在葉尖和葉緣,初期葉尖最先變黃,形成黃褐色的不規則病斑,隨后逐漸擴大并沿主葉脈向上蔓延,導致葉片枯萎下垂,病斑上不會出現黑色小點。Qian等[10]報道了浙江省溫郁金葉枯病的病原菌為擬康寧木霉Trichodermakoningiopsis,Chen等[7]對海南省溫郁金葉枯病進行了病原鑒定,認為其病原菌為彎孢霉Curvulariaclavata,并研究了其生物學特性及室內藥劑篩選。近幾年海南省溫郁金葉枯病的發病率已經降低了很多,而溫郁金新病害炭疽病有逐漸加重的趨勢,并且已成為制約海南省溫郁金生產發展的重要因素,常成片發病,重病區發病率達到90%以上,造成了巨大的經濟損失。據調查,溫郁金炭疽病在夏季雨季過后發病最為嚴重,說明高溫高濕的條件有利于病害的傳播。因此,在海南夏秋多雨季節,應避免溫郁金種植基地通風不良、密植或澆水過多的情況發生,除此之外,農事操作中,要注意盡量避免傷口,防止病菌的侵入,開展針對溫郁金炭疽病的抗病品種選育和無病種苗繁育工作,改進栽培措施,篩選高效防治藥劑,從而有效控制溫郁金炭疽病的發生和蔓延。