番茄莖腐病菌的分子鑒定及致病力檢測

張 怡, 李 幸, 董正偉, 王萌萌, 劉 翔,張 錦, 楊夢嬌, 孫 潁, 李成偉,2*

(1. 周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點實驗室, 周口 466001; 2. 河南科技學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007)

番茄是全世界栽培最普遍的蔬菜作物,在食品加工及蔬菜生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位[1]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計,我國番茄年產(chǎn)量均在5 000萬t以上,2015年則達(dá)到了5 594萬t,約占全國蔬菜(含瓜類)總產(chǎn)量的7.1%。因番茄經(jīng)濟(jì)價值和食用價值較高,其種植面積和產(chǎn)量呈逐年增加的趨勢[2]。

由于全球氣候變暖和番茄種植面積的增大,病蟲害嚴(yán)重影響了溫室大棚番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量。由鐮孢屬引起的莖腐病是致病性強(qiáng)、宿主范圍廣的真菌病害,可侵染番茄[3]、黃瓜[4]、玉米[5]等多種重要農(nóng)作物。其中由茄鐮孢引起的番茄莖腐病對番茄的植株和果實生長都造成了嚴(yán)重威脅,病原菌從植物的莖基部和根部侵入,初期癥狀不明顯,隨著病菌的侵入,莖部近地面部分呈黑色病斑,番茄地上部分變黃、萎蔫,嚴(yán)重時植株枯死,導(dǎo)致番茄的質(zhì)量下降,產(chǎn)量降低。目前施用農(nóng)藥是解決該病害的主要辦法,但長期噴施農(nóng)藥不僅會增加作物抗藥性,同時也增加了生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本。

從2014年開始,番茄莖腐病在河南省周口市鄲城縣等地的蔬菜大棚和溫室中有發(fā)生加重的趨勢,造成了番茄等多種蔬菜作物嚴(yán)重減產(chǎn)。本研究針對周口鄲城地區(qū)番茄莖腐病,采用形態(tài)學(xué)觀察、ITS序列鑒定和進(jìn)化樹分析對該病菌進(jìn)行研究,同時對該病菌的致病性進(jìn)行檢測,旨在為番茄莖腐病病菌的分類和抗病育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病原菌的采集分離與純化

1.1.1 病株采集

本試驗所用菌株來自河南省周口市鄲城縣李樓鄉(xiāng)小李樓蔬菜種植基地患病的15株番茄植株。

1.1.2 病原菌的分離與純化

從發(fā)病的番茄植株根部以及莖部,分別切取長約5～6 mm的一段。用75%乙醇浸泡90 s,無菌水沖洗2～3次,0.1%氯化汞處理7～8 min,無菌水沖洗5～6次,用無菌吸水紙將其表面水分吸干,然后將莖段放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上28℃倒置培養(yǎng)。當(dāng)其生長5～6 d時可以看到白色突起的菌落,用接種針挑取菌落邊緣菌絲,接種于新的PDA培養(yǎng)基上,進(jìn)行多次重復(fù)操作,直到菌落無雜菌。

1.2 病原菌形態(tài)觀察

用接種針挑取純化的番茄莖腐病菌的菌絲,將其接種于新的PDA平板中央,28℃恒溫箱培養(yǎng)7 d。觀察菌落形態(tài)、透明度、光澤度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征等。同時用無菌水沖洗菌落,充分振蕩,制成孢子懸浮液。沾取少量懸浮液于載玻片上,顯微鏡下觀察孢子形狀、大小、顏色,以及菌絲形狀、顏色、粗細(xì)等[6]。

1.3 病原菌柯赫氏法則驗證

挑取PDA平板上的新鮮菌絲,制成1×106個/mL的孢子懸浮液,在組培瓶中接種不同品種的番茄(‘LA3129’、‘LA3273’、‘LA3292’),置于20～22℃、濕度80%和光周期L∥D=16 h∥8 h的人工氣候箱中培養(yǎng),并以水接種作為對照。接種7～10 d后,觀察并記錄感病狀況,與本試驗采集的自然發(fā)病的番茄植株進(jìn)行比對。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 病原菌 DNA 的提取

采用生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)提取病菌DNA,方法參照說明書。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

采用真菌通用引物ITS1/ITS4對病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7],其反應(yīng)體系如下:基因組DNA 1 μL;10 μmol/mL的ITS1/ITS4引物各1 μL;2×EasyTaq Super Mix 10 μL;加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,34個循環(huán);最后72℃ 延伸5 min。

1.4.3 測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后,送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析,采用Clustal X和MEGA 6.0[8]軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.5 病原菌致病性檢測

從純化的番茄莖腐病菌菌落邊緣挑取少量菌絲接種于新的PDA平板中央,28℃恒溫箱培養(yǎng)5 d。用無菌水沖洗菌落,過濾,配制孢子懸浮液,用血球計數(shù)板將其稀釋到107個/mL,采用瓶內(nèi)親和互作體系[9]觀察該病原菌與番茄、龍葵、煙草、辣椒、茄子、擬南芥等植物的互作,每株植物接種1 mL稀釋后的孢子懸浮液,每種植物重復(fù)3次,7 d后觀察這些植物的生長狀況及發(fā)病程度,并采用莖段培養(yǎng)的方法檢測病原菌在植物中的生長[10],培養(yǎng)7～10 d后拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 病株及病原菌的形態(tài)特征觀察

對患病區(qū)域的番茄觀察發(fā)現(xiàn),在發(fā)病初期,根莖交界處發(fā)黑,整株發(fā)病癥狀尚不明顯(圖 1a),之后隨著病菌侵入的加重,整個植株葉片發(fā)黃萎蔫,嚴(yán)重者死亡。分離純化后的番茄莖腐病菌在PDA培養(yǎng)基28℃黑暗下培養(yǎng)7 d后,菌落呈較規(guī)則的圓形(圖 1b),邊緣較為光滑,菌落為白色,較為干燥,無金屬光澤;菌絲絨毛狀,生長旺盛。培養(yǎng)前期培養(yǎng)基無顏色變化,3～4 d后顏色略帶黃色或灰色,后期顏色逐漸加深。

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌絲細(xì)長,有分叉現(xiàn)象,在部分菌絲的頂端有厚垣孢子。有兩種不同形態(tài)的孢子,其中小型分生孢子為球棒形或腎形,無分隔,長4～8 μm。另一種為月牙形的大型分生孢子,孢子中間有橫隔,橫隔多為2～4個,其中3個居多(圖1c～d)。根據(jù)其菌落、菌絲、孢子等的形態(tài)初步鑒定為鐮孢屬真菌[11]。

圖1 番茄莖腐病菌的形態(tài)觀察Fig.1 Morphological characteristics of pathogen causing tomato stem rot

2.2 病原菌的柯赫氏法則鑒定

在3個番茄品種健康植株上接種病原菌7 d后,發(fā)現(xiàn)植株葉片出現(xiàn)不同程度的黃化和萎蔫,靠近根系部分的莖部均出現(xiàn)了黑色的病斑,與正常發(fā)病番茄植株的感病癥狀相似,病原菌微觀形態(tài)與分離的病原菌一致,進(jìn)一步說明分離的病原菌為鐮孢屬真菌。

圖2 分離病原菌接種正常植株的表型變化Fig.2 Phenotypic change of healthy tomato plants after inoculation of the isolated pathogen

2.3 病原菌的ITS序列分析

利用ITS通用引物對番茄莖腐病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的片段大小在500～750 bp之間(圖 2),將其純化后送至公司測序,最終獲得ITS序列大小為578 bp。將測序結(jié)果提交至NCBI的GenBank庫(登錄號:KM235740),并在NCBI上BLAST比對搜索同源性較高的序列進(jìn)行分析,采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行近鄰歸群分析,生成系統(tǒng)進(jìn)化樹,用Bootstrap對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗,重復(fù)1 000次。聚類分析后發(fā)現(xiàn),該病原菌的ITS序列與茄鐮孢福建分離物同源關(guān)系最近,聚在一起,與來自其他地區(qū)的茄鐮孢聚在一個大的進(jìn)化支上,進(jìn)一步證明本研究分離的病原菌為茄鐮孢。

圖3 ITS序列PCR擴(kuò)增圖Fig.3 PCR amplification of the pathogen ITS

圖4 構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of pathogen based on the neighbor-joining method

2.4 致病力檢測結(jié)果

本研究選取了茄科的栽培番茄、野生番茄、辣椒、茄子、龍葵、煙草以及十字花科的擬南芥等26種植物進(jìn)行致病力檢測試驗。瓶內(nèi)互作結(jié)果顯示病原菌侵染7 d后,所有參試植物均表現(xiàn)不同程度的感病癥狀(圖5),出現(xiàn)莖段發(fā)黑,葉片發(fā)黃、發(fā)黑并枯萎等癥狀。下胚軸培養(yǎng)后也可在PDA培養(yǎng)基上生長出病原菌菌落,尤其是龍葵(圖5b～b2),發(fā)病速度最快且發(fā)病程度嚴(yán)重,葉片最先出現(xiàn)萎蔫的現(xiàn)象,整株植物很快枯萎死亡,且感染病菌的龍葵葉片在培養(yǎng)基上培養(yǎng)后病原菌生長速度較其他植物快,因此龍葵可作為該病菌抗性育種的一個新的方向。由此推斷該病原菌不僅能侵染茄科植物,也能侵染其他科的植物,宿主范圍較廣,不僅危害植物的莖基部和根部,也可侵染葉片,從而影響植物的生長發(fā)育。

3 討論

番茄莖腐病是一種致病性土傳病害,近年來在各地的設(shè)施番茄生產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。本試驗結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法對采自河南周口地區(qū)蔬菜大棚發(fā)病番茄植株的病原菌進(jìn)行了鑒定,結(jié)果顯示該病原菌為茄鐮孢,與周黎等[12]分離的番茄根腐病病原菌一致。該病菌寄主范圍廣泛,可侵染多種蔬菜水果、草本觀賞植物及藥用植物,如茄子[13]、番木瓜[14]、紅掌[15]、藏紅花[16]、半夏[17]等,表明同一種病原菌可引起不同病害的發(fā)生。徐作珽等[18]將分離的番茄莖腐病病原菌鑒定為終極腐霉Pythiumultimum,說明不同地區(qū)的番茄莖腐病可能由不同的病原菌所引起。

圖5 病原菌致病力檢測Fig.5 Virulence test of the pathogen

本研究對番茄莖腐病病原菌的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),該病菌與分離自福建的茄鐮孢親緣關(guān)系最近,同時也與分離自印度和美國的茄鐮孢聚在一個小分化支上,而與分離自中國江蘇和徐州的茄鐮孢沒有聚在一個進(jìn)化支上,說明該病原菌的進(jìn)化與地域的遠(yuǎn)近沒有直接關(guān)系,該結(jié)果與來自河南小麥白粉菌的進(jìn)化結(jié)果類似[7],推測病原菌的進(jìn)化可能與自身小種進(jìn)化相關(guān)。

本試驗對病原菌的致病性檢測采用瓶內(nèi)互作檢測的方法,在無菌條件下對植株進(jìn)行接菌試驗,避免了外界雜菌的干擾以及一些外界環(huán)境中不確定因素的影響,提高了試驗的準(zhǔn)確度及可信度,為本試驗提供了可靠的數(shù)據(jù)。該病原菌對茄科部分植物的致病性檢測發(fā)現(xiàn),供試的栽培番茄(14個品種)、野生番茄(2個品種)、煙草(3個品種)、辣椒(2個品種)和哥倫比亞擬南芥均是該病菌的寄主,表明該病菌寄主范圍廣,并首次發(fā)現(xiàn)該病原菌對茄科植物龍葵的致病力較強(qiáng),為以后番茄莖腐病的抗病研究提供了新的思路。也有研究發(fā)現(xiàn)同屬的尖鐮孢還可侵染瓜類、十字花科和豆科植物,表明鐮孢屬真菌的寄主范圍較廣[19]。

本研究結(jié)合常規(guī)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)方法對分離自周口的番茄莖腐病病原進(jìn)行鑒定,并對其致病性進(jìn)行檢測,為番茄莖腐病的分類和防治提供了理論依據(jù)。