我國12個地區草莓葉螨種類分子鑒定及遺傳多樣性

曹利軍, 周曉怡,2, 宮亞軍, 魏書軍*

(1. 北京市農林科學院植物保護環境保護研究所, 北京 100097; 2. 長江大學農學院, 荊州 434025)

草莓具有非常豐富的營養價值,我國草莓栽培面積超過10萬hm2,年產量超過270萬t,年產量和栽培面積超過了世界總量的1/3,現穩居世界第一位[1]。隨著草莓的廣泛種植,害蟲為害也日漸嚴重。葉螨是草莓上為害最為嚴重的害螨,直接影響草莓的產量和品質。受葉螨為害的草莓植株會矮化早衰,葉片變褐色及干枯,開花期受害植株的果實縮小,且畸形果增多,草莓的品質嚴重下降[2]。葉螨具有個體微小、世代周期短和繁殖力強等特點,在實際生產中頻繁用藥和不合理用藥等導致葉螨抗藥性產生迅速[3-5]。前人的研究認為草莓上有多種葉螨,包括二斑葉螨Tetranychusurticae[6]、截形葉螨Tetranychustruncates[7]、朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus[2]和神澤葉螨Tetranychuskanzawai[8]等。隨著草莓種植面積的逐年擴大、農藥的大量使用以及耕作制度的改變,草莓上主要葉螨種類是否發生了變化？明確這一問題對于制定合理的葉螨防控策略,提高防治效果有重要參考價值。

然而,不同種類葉螨的卵、若螨和成螨均缺少差異明顯的形態特征,并且形態特征易受性別和發育階段的影響,通過形態鑒定葉螨種類存在較大困難[9-10]。基于DNA序列的分子鑒定技術是一種準確又快速的鑒定葉螨種類的方法,其中線粒體基因cox1序列、核糖體轉錄間隔區2(ITS2)序列和限制內切酶片段長度多態性技術(RFLP)等是葉螨分子鑒定的常用標記[9-11]。本研究采用了通用引物容易獲得、擴增成功率較高的cox1序列對我國草莓主要產區的葉螨種類進行了快速鑒定,并分析了葉螨種群的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 標本采集與DNA提取

供試葉螨樣本來自全國12個草莓產區(表1),覆蓋了我國華北、華中、華東和西南的草莓產區,且在空間上分布均勻。采集標本時,每個樣點采3～5片帶有葉螨的草莓葉片放入自封袋,每個地區采集15個以上樣點,每個樣點間距5 m以上。將每個自封袋中的葉螨標本挑入1個裝有無水乙醇的2 mL離心管中,-80℃保存用于提取DNA。

表1草莓葉螨樣本采集信息

Table1Samplinginformationofthestrawberryspidermites

采集地點Location經緯度Lat, Lon采集時間/年-月Date檢測樣本數/個Sample size北京延慶北菜園40°32'13.2″N, 116°9'57.6″E2017-048北京昌平萬德園40°13'19.2″N, 116°12'57.6″E2017-038北京平谷夏魚路40°10'44.4″N, 117°13'58.8″E2017-058山西陽泉盂縣萇池鎮小獨頭村35°50'6″N, 113°21'36″E2017-038河北衡水龐莊村37°44'49.2″N, 115°41'9.6″E2017-038山東日照莒縣棋山鎮三莊村35°50'6″N, 118°54'10.8″E2017-038安徽淮南市潘集區后湖生態園32°48'32.4″N, 116°51'39.6″E2017-035上海市浦東新區苗橋路31°8'9.6″N, 121°37'58.8″E2017-048浙江嘉興市嘉善縣魏塘街道智果村30°53'2.4″N, 120°56'24″E2017-058四川成都貴和農業公園30°40'48″N, 104°4'4.8″E2017-038江西南昌八一鄉涂家村28°34'15.6″N, 115°57'3.6″E2017-058湖南長沙市長沙縣三興村28°2'20.4″N, 112°57'46.8″E2017-048

在顯微鏡下初步觀察葉螨形態,從每個種群選取5～8頭個體色有差異或空間上相距較遠的成螨提取DNA,共計93頭成螨。提取過程為:將單頭葉螨放入含有10 μL裂解緩沖液的0.2 mL的PCR管中,并使用燒制過的移液器吸頭尖端擠壓碾碎,使組織在裂解緩沖液中消解,短暫離心后將PCR管放置在-80℃下30 min,隨后在金屬浴65℃下孵育1 h,最后在95℃下保持15 min[12]。其中組織裂解液配方為:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2),50 mmol/L KCl,2.5 mmol/L MgCl2,0.45%Tween-20,0.01%明膠,60 μg/mL蛋白酶K[12]。

1.2 基因序列的PCR擴增

PCR反應體系總體積為15 μL:buffer (Mg2+) 1.5 μL,dNTPs 1.5 μL,上下游引物各0.3 μL,LATaq酶0.2 μL,模板DNA 2 μL,加ddH2O補充總體積為15 μL。本研究先后使用了2對引物進行擴增,先使用引物LEPF1/LEPR1進行PCR擴增,擴增不成功的樣品用自己設計的引物AF-TU/AR-TU進行擴增。LEPF1/LEPR1是參考Hebert等[13]的引物并修改,上游引物為LEPF1:5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3′,下游引物為LEPR1:5′-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAA-TCA-3′;AF-TU/AR-TU是根據GenBank數據庫登記的葉螨序列重新設計的引物,上游引物AF-TU:5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′,下游引物AR-TU:5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增程序為94℃預變性5 min;94℃變性30 s,44℃退火30 s,60℃延伸1 min,35個循環;最后修復延伸10 min。PCR擴增產物送至北京擎科新業生物技術有限公司進行雙端測序。

1.3 測序和序列分析

將測序序列用MEGA 7.0121軟件進行比對[14]。使用DnaSP 5.0分析葉螨cox1基因的單倍型數,計算多樣性參數[15]。將DnaSP 5.0分析得到的不同單倍型在GenBank數據庫中用BLAST工具進行搜索。

從GenBank數據庫下載Tetranychus屬的cox1序列,所選取序列包含本研究所測定區域。下載的數據在同行評審期刊上發表的論文里使用過,或者序列對應的標本經葉螨分類專家鑒定。來自同一個國家的相同序列,只保留一個。通過MEGA 7.0121軟件[14],利用鄰接法(neighbor-joining, NJ)[16]構建基于Kimura雙參數模型(Kimura-2-parameter, K2P)[17]的系統發育樹,重復1 000次bootstrap檢驗[18],計算各個節點的支持率。

2 結果與分析

2.1 cox1基因PCR擴增

除浙江嘉興地區的2頭葉螨未能擴增得到序列外,其余地區選取的樣本均成功獲得cox1基因序列,共獲得91個樣品的cox1序列。其中,LEPF1/LEPR1從81頭葉螨中擴增到目的片段,AF-TU/AR-TU從10頭葉螨中擴增到目的片段。

2.2 物種鑒定

PCR擴增產物經測序后,得到的cox1基因部分序列的長度為632 bp。DnaSP 5.0分析表明,草莓上的葉螨有2種單倍型。將2種單倍型序列在GenBank數據庫中進行BLASTn比對,結果(圖 1)表明:其中一種單倍型序列(包含86個個體)與GenBank數據庫中的二斑葉螨綠色型序列(GenBank序列號:KJ729022)[19]相似度為100%,命名為單倍型a (hap a);另一種單倍型與單倍型a相比,有1個核苷酸的同義(GGA/GGG)突變,與二斑葉螨綠色型序列相似度大于99.8%,命名為單倍型b (hap b)。系統發育分析表明,2種單倍型與二斑葉螨綠色型聚為一支,和二斑葉螨紅色型有較近的親緣關系,而與其他葉螨的遺傳距離較遠。分子鑒定結果明確了我國草莓上的葉螨均為二斑葉螨綠色型。

圖1 基于cox1序列構建的葉螨NJ系統發育樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree of the spider mites based on cox1 gene sequences

2.3 遺傳多樣性

使用DnaSP 5.0統計cox1序列多樣性,發現單倍型a存在于所有的種群中,而單倍型b僅在北京昌平種群中的5個個體中發現(圖1)。單倍型b在其他研究中尚未報道過。結果表明,我國草莓上二斑葉螨線粒體cox1基因的遺傳多樣性非常低。

3 討論

二斑葉螨原在歐洲和美國普遍發生,20世紀80年代以前在我國未曾發現。1983年,在北京市天壇公園花卉上首次發現了二斑葉螨[20],隨后在1990年和1991年在河北昌黎、甘肅天水的果樹上相繼被發現[21]。1994年,二斑葉螨在我國僅局部分布于臺灣島、北京市和天水市郊[22]。此后,以上述各地區域為中心,向其他地區擴散。有研究認為,二斑葉螨在我國主要分布于東北、華北、西北及蘇皖兩省北部[6],在海南和廣東的作物上沒有分布[5],但有研究者在我國南方的廣東和四川也發現了二斑葉螨的危害[23]。本研究在四川成都、江西南昌和湖南長沙均采集到了草莓上二斑葉螨的樣本。此外,Sun等[24]對二斑葉螨種群遺傳學的研究中也采集到我國南方的多個二斑葉螨種群,例如在湖南長沙(寄主為豇豆)、江西九江(棉花)、浙江慈溪(棉花)和云南玉龍(菜豆)。本實驗室在調查過程中,在海南豆角上也發現了二斑葉螨(未發表),由此可見二斑葉螨在我國南方已經建立了穩定的種群,分布范圍進一步擴大。

二斑葉螨主動擴散的能力有限,但可以憑借風力、流水、昆蟲、鳥獸和人畜等多種途徑進行傳播,其中農具和花卉苗木攜帶是二斑葉螨長距離傳播的主要途徑[24]。近年來對入侵物種的研究表明,種群遺傳學研究方法是分析入侵物種傳播擴散過程的有力手段[25]。本研究采集的樣本包括我國12個地區草莓上的葉螨種群,南北最遠相距1 500多公里,東西橫跨近2 000公里。但是只發現了2種線粒體單倍型,其中絕大多數地區只有1種單倍型。這可能反映了我國二斑葉螨的起源種群比較單一,入侵到我國之后隨種苗調運發生了二次傳播。而北京昌平具有2種單倍型,可能反映了該園區的種苗調運較為復雜。實際上該園區草莓品種較多,有很多直接從國外引進的品種。

從20世紀90年代開始國內學者開始關注為害草莓的葉螨,包括朱砂葉螨和神澤葉螨[2,8]。本研究發現我國草莓主要產區為害草莓的葉螨只有二斑葉螨,未發現神澤葉螨。由此推斷二斑葉螨可能已經成為這些地區為害草莓的優勢種。出現這種情況的原因,可能是作為入侵種的二斑葉螨比本地種適應能力更強,其入侵擴散導致了對當地相似生態位的物種的取代[26];也可能是二斑葉螨經過長期的藥劑篩選后逐漸取代了其他葉螨,從一種次要害螨上升為主要害螨[27]。另外,耕作制度和栽培模式的變更,可能創造了更加適宜二斑葉螨生存的環境。

本研究明確了我國草莓上的主要葉螨種類為二斑葉螨,對于制定草莓害螨防治策略,減少農藥濫用,管理葉螨抗藥性等具有重要的指導意義。