海南芒果蒂腐病菌對吡唑醚菌酯的抗藥性測定

賀 瑞, 趙 磊, 符 瑞, 陳芷岑, 林曉翠, 楊 葉*

(1. 海南大學熱帶農林學院, 海口 570228; 2. 海南醫學院, 海口 571101)

芒果MangiferaindicaL.是著名的熱帶水果,是熱帶亞熱帶重要的經濟作物。海南是芒果的主要產區,芒果產量和種植面積皆位居全國首位。芒果蒂腐病是芒果采后最為嚴重的病害之一,可導致果實迅速腐爛,造成芒果在貯藏、運輸環節的巨大經濟損失,嚴重制約芒果產業的發展[1-2]。可可球二孢Botryodiplodiatheobromae是引起芒果蒂腐病的主要病原菌[3-5],該菌具有潛伏侵染特性,通常在幼果期侵入并潛伏于果實中,直到芒果果實成熟時才在果實上表現癥狀,隨后迅速擴展。由于該病原菌在大田期間就已侵入芒果,而芒果種植期間大量頻繁使用殺菌劑防治各種病害,對芒果蒂腐病病原菌造成了很大的藥劑選擇壓力[6],使得該病菌面臨產生嚴重的抗藥性風險。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑通過與病原菌細胞線粒體中的cytb和c1復合體Qo部位結合,抑制線粒體的電子傳遞,抑制能量生成,達到殺菌的目的。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑具有廣譜性和極高的殺菌活性,對環境也比較安全[7]。1996年該類殺菌劑開發應用后不久小麥白粉病便對其產生了抗性,隨后在葉枯病的防治中也出現了嚴重問題。目前,抗藥性已經成為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的一個重要問題。2009年及2014年先后有研究者報道芒果蒂腐病病菌對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑醚菌酯、嘧菌酯及吡唑醚菌酯等殺菌劑產生抗藥性[6,8]。目前在芒果生產上,甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑尤其是吡唑醚菌酯的使用量非常大。本研究2016年從海南芒果主要產區采收生理成熟的果實,待其后熟后取蒂腐病病果進行病原菌分離、純化和鑒定,并測定了分離菌株對吡唑醚菌酯的抗藥性,旨在進一步明確芒果蒂腐病病菌對吡唑醚菌酯的抗性水平,為海南芒果蒂腐病的科學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試藥劑

96%吡唑醚菌酯原藥由海南正業中農高科股份有限公司提供,用丙酮溶解,然后用0.2%吐溫-80溶液定容,配制成2.5×104mg/L的母液。99%水楊羥肟酸由上海麥克林生化科技有限公司提供,用丙酮溶解并配制成5×104mg/L的母液,于4℃冰箱中保存,備用。

1.1.2 供試菌株

供試菌株為本實驗室分離、鑒定的芒果蒂腐病菌Botryodiplodiatheobromae菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株的分離、純化、鑒定與保存

將從海南儋州、昌江、樂東、東方、三亞及陵水6個芒果主要產區采回的芒果置于室溫貯藏,待其后熟后挑選感染芒果蒂腐病的果實,采用組織分離法分離病原菌。從病果沿病斑邊緣取3 mm×3 mm的小塊若干,浸入0.1%升汞酒精消毒30 s,無菌水清洗3次后置于PDA平板上,待菌落長出后,從邊緣取菌絲轉移到新的PDA平板上進行純化,觀察菌落的形態、顏色等。培養20 d后在顯微鏡下根據分生孢子形態進行鑒定,按柯赫氏法則回接芒果確認為致病菌后將其轉移到PDA斜面上培養7 d,保存在4℃下備用。

1.2.2 芒果蒂腐病菌B. theobromae對吡唑醚菌酯的抗藥性檢測

采用區分劑量法[9]測定95株芒果蒂腐病菌株對吡唑醚菌酯的抗藥性。以不含藥的PDA培養基為空白對照,加等量丙酮的PDA培養基為溶劑對照,吡唑醚菌酯的濃度為10 mg/L(質量濃度)。為降低旁路呼吸途徑對藥劑的影響,供試培養基中加入終濃度為50 mg/L的水楊羥肟酸。每處理設置3個重復。置于28℃培養箱中培養36 h 和48 h 后用十字交叉法測量菌落直徑,并計算菌絲生長抑制率和校正后的生長抑制率(消除丙酮對菌絲生長的影響)。統計敏感、抗性菌株的發生頻率。參照Kim等和喬廣行等[10-11]的文獻,將在含10 mg/L吡唑醚菌酯的PDA平板上菌落直徑小于空白對照的40%的菌株判定為敏感菌株;菌落直徑大于等于空白對照的40%的菌株判定為抗性菌株。

生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.2.3 吡唑醚菌酯對芒果蒂腐病菌的毒力測定

采用系列稀釋法。在抗藥性檢測的基礎上,分別配制吡唑醚菌酯終濃度為0.69 、2.06、6.17、18.52、55.56、166.67、500 mg/L的含藥培養基,并在培養基中加入終濃度為50 mg/L的水楊羥肟酸。根據1.2.2的結果,去除部分遺傳性狀不穩定、來源及生長狀況完全相同的菌株,最終選取57株菌作為供試菌株進行毒力測定,供試菌株在PDA上平板上培養3 d后用5 mm 直徑打孔器取菌餅,分別接種到7個不同濃度梯度的含藥培養基上,以不含藥的PDA培養基為對照,每濃度設置3個重復,置于28℃培養箱中培養,于36 h和48 h用十字交叉法測量菌落直徑,并根據藥劑濃度對數和菌絲生長抑制率用DPS和Microsoft Excel 2013軟件計算出各菌株的毒力回歸方程、EC50及95% 置信區間。由各菌株所測的EC50構建吡唑醚菌酯對蒂腐病菌EC50的正態分布圖。

根據測定結果及相關參考文獻,本研究將蒂腐病菌對吡唑醚菌酯的抗性等級按以下標準劃分:EC50≤10 mg/L的為敏感菌株,10200 mg/L的為高抗菌株[12]。參照FAO 標準[13],計算各菌株的抗性水平(菌株EC50/最小EC50)。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離

從具有典型蒂腐病癥狀的芒果中分離的蒂腐病病菌大部分來自于昌江、樂東、三亞、陵水等市縣,從昌江縣分離菌株27個,樂東縣分離菌株19個,三亞市分離菌株25個,陵水縣分離菌株18個,東方市分離菌株3個和儋州市分離菌株3個。

2.2 芒果蒂腐病菌B. theobromae對吡唑醚菌酯的抗藥性檢測

采用區分劑量法對95個菌株進行抗藥性測定的結果表明,在含10 mg/L吡唑醚菌酯的PDA平板上有39個菌株菌落直徑小于空白對照的40%,判定為敏感菌株;有56個菌株菌落直徑大于空白對照的40%,判定為抗性菌株,抗性菌株發生頻率為58.95%(表1)。

海南不同芒果產區均檢測到抗性菌株,各地抗性菌株的發生頻率差異不大,抗性頻率在52.63%～66.67%之間。其中,昌江、樂東、三亞及陵水4個芒果產區的抗性頻率比較一致,說明海南省芒果蒂腐病病菌對吡唑醚菌酯普遍產生了抗藥性,且各地區之間差異不大。另外,東方及儋州地區分離出的菌株數量太少,尚不能完全代表該地區的抗藥性水平。

表1海南芒果蒂腐病菌對吡唑醚菌酯的抗性頻率

Table1ResistancefrequenciesofBotryodiplodiatheobromaeisolatestopyraclostrobininHainanProvince

產區Region菌株總數/株Testedisolate 敏感菌株/株Susceptibleisolate抗性菌株/株Resistantisolate抗性頻率/%Resistancefrequency昌江 Changjiang27121555.56 樂東 Ledong1991052.63 三亞 Sanya2591664.00 陵水 Lingshui1871161.11 東方 Dongfang31266.67 儋州 Danzhou31266.67 合計 Total 95395658.95

2.3 吡唑醚菌酯對芒果蒂腐病菌的毒力測定

吡唑醚菌酯對供試的57個菌株的EC50在3.12～1 525.43 mg/L之間(表2)。供試菌株中,5株敏感菌株的平均EC50為5.39 mg/L;低抗菌株有14株,平均EC50為45.34 mg/L;中抗菌株有18株,平均EC50為144.72 mg/L;20株高抗菌株的平均EC50為514.46 mg/L,高抗菌株的平均EC50是敏感菌株的95.45倍。其中2個菌株YZHJ90402和YCJH70401的EC50甚至超過1 000 mg/L。抗性水平在10～100倍的菌株有33個,占總菌株數的57.89%,大于100倍的菌株有13個,占總數的22.81%,而抗藥性最高的菌株的抗性水平是最敏感菌株的488.92倍。

表2吡唑醚菌酯對57株蒂腐病菌的毒力

Table2Toxicityof57BotryodiplodiatheobromaeisolatestopyraclostrobininHainanProvince

菌株Isolate回歸方程Regression equation相關系數Relative coefficientEC50/mg·L-195%置信區間/mg·L-195% CL抗性水平 (RF)Resistance factor抗性等級Resistant gradeYZTN100503y=4.792 7+0.435 7x0.926 43.121.93～4.31-SDFTN40801y=4.733 5+0.567 1x0.982 23.241.35～5.131.04SDFTN41002y=4.745 4+0.434 3x0.943 84.082.30～5.861.31SYCJH70107y=4.748 0+0.302 3x0.944 57.223.69～10.752.31SYCXY70602y=4.663 0+0.353 4x0.979 59.283.19～15.372.97SCJXY30101y=4.540 0+0.394 9x0.991 315.683.59～27.775.03LRCJTN20301y=4.619 3+0.306 3x0.959 718.007.52～28.485.77LRJSJH10101y=4.691 5+0.247 8x0.946 218.829.69～27.956.03LRCJJH20803y=4.421 7+0.440 9x0.975 321.877.64～36.107.01LRHLTN10402y=4.503 7+0.377 2x0.980 922.167.97～36.357.10LRYCXY70704y=4.218 9+0.525 9x0.957 331.0613.07～49.059.96LRLDJHy=4.327 2+0.456 9x0.909 131.8219.36～44.2810.20LRCJXY30601y=4.507 5+0.330 1x0.978 433.4510.97～55.9310.72LRYZTN10601y=4.080 3+0.559 7x0.957 846.3021.45～71.1514.84LRCJTN20302y=4.313 2+0.408 3x0.995 052.7011.23～94.1716.89LRYZHJ90401y=4.193 8+0.443 4x0.885 766.8846.24～87.5221.44LR

續表2Table2(Continued)

菌株Isolate回歸方程Regression equation相關系數Relative coefficientEC50/mg·L-195%置信區間/mg·L-195% CL抗性水平 (RF)Resistance factor抗性等級Resistant gradeYCTN70103y=4.167 1+0.431 6x0.906 888.1257.51～118.7328.24LRCJJH20103y=4.524 4+0.247 8x0.950 588.4947.66～129.3228.36LRCJJH20505y=4.020 8+0.490 2x0.953 699.4353.17～145.6931.87LRHLTN50801y=3.976 8+0.507 7x0.986 1106.8034.48～179.1234.23MRYCHJ80103y=4.161 9+0.410 5x0.963 5114.8958.90～170.8836.82MRDFTN40802y=4.006 8+0.484 8x0.975 3116.9650.33～183.5937.49MRHLTN50805y=4.035 2+0.473 5x0.909 8118.3481.71～154.9737.93MRCJJH20801y=4.264 8+0.354 1x0.978 1119.6246.79～192.4538.34MRYCHJ90103y=3.846 3+0.558 3x0.961 3125.4364.29～186.5740.20MRHLTN51002y=4.106 2+0.428 9x0.940 5128.4478.89～177.9941.17MRYCHJ80401y=4.080 7+0.433 9x0.994 2133.2732.30～234.2442.71MRCJJH20201y=4.277 0+0.339 5x0.965 9136.3463.34～209.3443.70MRCJTN30205y=4.079 8+0.435 9x0.955 9140.8482.25～199.4345.14MRDZTN110104y=3.764 1+0.577 6x0.959 5151.1285.11～217.1348.44MRYZJH100102y=4.296 8+0.322 8x0.960 9153.1281.86～224.3849.08MRJSTN10102y=4.029 6+0.445 4x0.975 0158.9374.91～242.9550.94MRCJJH20705y=3.800 3+0.543 2x0.953 9172.5199.50～245.5255.29MRCJJH20106y=3.940 2+0.478 7x0.959 1173.2095.36～251.0455.51MRCJTN30101y=4.285 9+0.321 9x0.944 4178.66110.56～246.7657.26MRYZHJ90301y=4.060 1+0.421 5x0.967 1181.5392.61～270.4558.18MRYZTN100301y=4.060 0+0.416 5x0.971 8194.8899.94～289.8262.46MRYCXY70301y=3.774 5+0.525 4x0.953 5221.56130.43～312.6971.01HRYZJH100201y=4.086 7+0.389 8x0.950 8230.03136.61～323.4573.73HRCJTN10501y=3.669 4+0.554 9x0.976 0251.63115.04～388.2280.65HRYCXY70702y=3.803 8+0.499 7x0.997 6259.1551.78～466.5283.06HRYCHJ80301y=3.998 7+0.413 8x0.942 2266.75175.01～358.4985.50HRJH21617y=3.326 5+0.693 0x0.913 4270.23198.70～341.7686.61HRCJXY30103y=3.752 0+0.505 7x0.957 6295.13173.81～416.4594.59HRHLTN22602y=3.599 0+0.563 0x0.954 3312.76186.20～439.32100.24HRYZTN100303y=3.876 2+0.449 7x0.994 3341.31115.55～567.07109.39HRDTN83108y=4.120 5+0.350 0x0.932 4342.15245.27～439.03109.66HRDTN31605y=4.263 3+0.291 7x0.967 9357.08197.19～516.97114.45HRCJJH20502y=4.186 4+0.312 7x0.951 4436.16293.80～578.52139.79HRHLTN51001y=3.589 0+0.538 4x0.990 1453.90170.10～737.70145.48HRYZHJ90103y=3.804 9+0.436 9x0.968 5557.11331.31～782.91178.56HRYCJH70402y=3.562 1+0.518 1x0.995 1641.00187.88～1 094.12205.45HRYCHJ80203y=3.912 1+0.387 1x0.942 1709.49519.81～899.17227.40HRHLTN50901y=3.582 6+0.495 4x0.905 5752.35615.60～889.10241.14HRYCTN70102y=3.114 2+0.652 3x0.988 9825.34353.18～1 297.50264.53HRYZHJ90402y=4.194 5+0.262 8x0.952 71 240.54921.66～1 559.42397.61HRYCJH70401y=3.801 9+0.378 0x0.975 51 525.43909.53～2 141.33488.92HR

正態性檢驗表明,吡唑醚菌酯對57株蒂腐病菌株的EC50頻率分布呈現近似連續性正態分布,趨勢平緩(圖1),Sk=0.86>0,σ1=0.661,Sig.=0.2>0.05;Ku=0.654>0,σ2=1.279,Sig.=0.533>0.05。說明供試的蒂腐病病菌對吡唑醚菌酯的敏感性存在一定分化。吡唑醚菌酯對供試蒂腐病菌株的EC50頻率分布呈現先上升后下降趨勢,多數菌株對吡唑醚菌酯的抗性處于中抗或高抗水平,敏感菌株則較少,其中EC50在700～2 000 mg/L范圍的菌株對吡唑醚菌酯表現出極高的抗性。表明田間表現中抗菌株為優勢群體,而抗性頻率呈典型的單峰曲線,也說明該類藥劑產生抗藥性的風險極大。

圖1 吡唑醚菌酯對海南芒果蒂腐病菌EC50的正態分布圖Fig.1 Normal distribution for EC50 values of 57 Botryodiplodia theobromae isolates to pyraclostrobin in Hainan

3 討論

海南省西南部冬、春干旱少雨,旱期長、氣溫高的“干熱”氣候適合發展芒果產業,現已成為海南省主要的芒果生產基地。但常常由于臺風等自然條件的影響,病蟲害發生十分嚴重。當前,芒果蒂腐病的防治主要依賴化學藥劑,吡唑醚菌酯是推薦用藥之一[14-15]。良好的防效使得吡唑醚菌酯的使用次數和使用量不斷增加,導致芒果蒂腐病病菌對其產生了不同程度的抗性,因此定期檢測該菌對吡唑醚菌酯的抗性分布及抗性水平,對該病菌進行抗性跟蹤監測非常必要。王萌等[16]于2014年檢測了海南省芒果蒂腐病病菌對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗性,結果表明,對醚菌酯表現抗性的菌株頻率達90.00%,對嘧菌酯和吡唑嘧菌酯表現抗性的菌株頻率分別為76.67%和53.33%。2016年本課題組對海南省芒果蒂腐病病菌對吡唑醚菌酯的抗性進行了跟蹤檢測,表明對吡唑醚菌酯表現抗性的菌株頻率為58.95%。與王萌等的測定結果相似,說明海南芒果蒂腐病病菌對吡唑醚菌酯的抗性已非常普遍。而本次研究發現田間該菌對吡唑醚菌酯的抗性有所增加,測試的57個菌株中EC50超過100 mg/L的菌株達38個,占供試菌株的66.67%, EC50大于500 mg/L的菌株有7個。吡唑醚菌酯對海南芒果蒂腐病病菌的EC50呈正態分布,以中抗和高抗菌株為優勢群體。

來自海南不同產區的芒果蒂腐病菌株對吡唑醚菌酯的抗性頻率差異不大,這與海南特殊的地理環境有關,海南省面積不大,各芒果產區的各種氣候條件比較一致,而芒果生產期間在藥劑選擇及應用上以經驗為主,種植戶之間常常是盲目跟風,致使吡唑醚菌酯被大量頻繁使用,造成了病原菌的抗性風險和抗性現狀。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑自1996年開發用于市場后不久便于1998年在德國北部小麥白粉病上發現了抗性菌株,并在北歐地區迅速蔓延,研究者于2003年在法國北部、瑞典和丹麥均檢測到抗性菌株。隨后又在美國密歇根州的蘋果種植區發現甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗性菌株。2010年,研究者在伊利諾伊州和田納西州大學研究大豆灰斑病時發現了對該類殺菌劑產生抗性的菌株,并確定該類殺菌劑對引起大豆灰斑病的病原菌的抗性風險屬于高風險[17]。在我國,對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產生抗性的現象也很嚴重,2006年從山東省采集的黃瓜霜霉菌株中尚未檢測到對該類藥劑出現抗性的菌株[18],2007年再次采集該地區菌株時,出現了57株抗性菌株,抗性水平在21.15～2618.9倍之間,有些菌株的抗性水平甚至大于2618.9倍,這些研究結果與本研究類似,說明病原菌對該類殺菌劑的抗性風險很高,因此,科學合理使用該類藥劑,對減緩抗藥性的產生尤為重要。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是細胞呼吸抑制劑,芒果蒂腐病病菌對該類藥劑已普遍產生抗性。隨著分子生物學技術的快速發展,分子技術被用于病原菌對殺菌劑的抗性檢測,對一些殺菌劑的作用機制和病原菌的抗性位點已有了較深入的研究,病原菌對殺菌劑敏感性降低是基因突變引起的,主要是Cytb基因的點突變引起。后續,我們將繼續研究芒果蒂腐病菌對該類殺菌劑產生抗性的機制,進一步探索該類藥劑的作用機理。