一種注射桑樹冬芽轉化方法的初探

林天寶，劉 巖，計東風，朱 燕，魏 佳，呂志強

（浙江省農業科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021）

桑樹是一種重要經濟林木，在食品、醫藥保健、繭絲綢和生態等領域都具有重要作用［1～2］。長期以來，桑樹主要通過雜交和多倍體育種方式進行品種改良，雖然已經選育多個優良品種，但由于桑樹生長周期長，遺傳雜合性高，傳統的育種方法往往需要花費漫長時間，并且很難做到對有價值遺傳性狀的定向育種［3～5］。

隨著現代分子生物學的發展，建立穩定的遺傳轉化系統，導入優良的外源基因，將有利于定向提高桑葉的產量和質量，增強桑樹抗病性和抗逆性的研究［5～8］。桑樹上最早的轉基因報道是日本學者Machii等［9］利用農桿菌LBA4404浸染桑樹葉片，誘導獲得GUS組織化學染色陽性的不定芽。此后，陸小平等［10～11］對桑樹幼苗子葉腋隙進行刺傷，接種感染工程農桿菌，利用GUS基因、Km記恨做探針的檢測到較強的雜交信號；王洪利等［12］利用桑樹莖尖的轉化法報道由初步研究結果。Vibha［13］在印度桑（Morus indica L.cv.K2）中過表達大麥（barley）胚胎發育晚期豐富蛋白家族成員HVA1，證實轉基因植物耐旱、耐鹽和抗寒性都得到改善［14～15］。2011 年，Manaswini等將Osmotin蛋白基因轉入K2印度桑中，轉基因植物對干旱、鹽脅迫以及真菌脅迫表現出更強的耐受性［16］。然而除印度桑外，其他關于桑樹轉基因研究的報道仍相對較少，特別是國內實用果桑品種的遺傳轉化方面。西南大學李鎮剛等人［17］利用花粉介導的轉基因方法進行了研究；以及近年陸續有報道利用桑樹轉基因毛狀根的誘導和繁殖方法、病毒介導的基因沉默的研究探索等；但總體上，采用轉基因技術進行桑樹遺傳育種的研究尚處于起步階段，還亟需開展更多地探索和研究。

為此，本文選擇萌動期的桑樹冬芽，以注射方法轉化攜帶β-glucuronidase（GUS）和卡那霉素（Kan）報告基因的重組農桿菌，對冬芽處理枝條的葉片進行GUS酶活性染色和特異性片段的PCR擴增鑒定，以及果實的GUS染色、桑種子的卡那霉素抗性篩選研究。結果證實通過該方法能篩選到陽性轉基因桑樹植株，這為今后開展桑樹功能基因研究和品種改良選育提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

攜帶β-葡萄糖甘酸酶基因（GUS）和抗卡那霉素（Kan）報告基因的根癌農桿菌菌株（GV-pBI121）由浙江省農科院沈國新研究員惠贈。所含標記基因GUS受花椰菜花葉病毒的35S啟動子控制。

1.2 農桿菌的培養

取保存菌種接種在含有卡那霉素（Kan 100 mg·L-1）和利福平（Rif 50 mg·L-1）兩種抗生素的LB培養基上，置于28℃恒溫培養箱內培養，挑取單菌落，接種于含有卡那霉素（50 mg·L-1）和利福平（50 mg·L-1）的液體LB培養基，置28℃恒溫下震蕩培養（200 r·min-1）至菌液濃度（OD600=0.5）時備用。

1.3 供試桑樹品種及浸染轉化

試驗用臺灣果桑品種72C002由本課題組基地栽培和保存。選擇冬芽即將萌發前作為微注射轉染時期。取上述菌液，室溫離心15 min（4000 r·min-1）。棄上清，用等量體積的浸染緩沖液（MES 0.25g·L-1，Myo-inositol 0.10g·L-1，MS with Gamborg Vitamins 2.22g·L-1，L-glutamine 0.20g·L-1，D-galactose 1.80g·L-1，pH 5.0）懸浮農桿菌。利用1 ml注射器將農桿菌浸染液注射入桑樹冬芽，每芽0.1 mL。注射完成后，取鋁箔紙包住枝條，暗處理48 h后，剝離鋁箔紙，繼續培養。分別采集農桿菌注射后枝條生長的葉片、桑果和桑種子做后續檢測分析。

1.4 GUS酶活性顯色

GUS酶活檢測方法參照文獻［18］，取檢測樣品置于X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄醛酸）染色液（phosphate buffer 50 mmol·L-1，pH 7.0，Ferrocyanide 3 mmol·L-1，Ferricyanide 3mmol·L-1，Triton X-100 0.2 mmol·L-1，X-Gluc 2 mmol·L-1）中，真空泵反復抽氣3次后，置于37恒溫箱染色過夜。然后棄去染色液，加入70%乙醇脫去樣品葉綠素，觀察并記錄樣品染色結果。

1.5 DNA抽提及GUS基因的擴增

利用Omega植物基因組抽提試劑盒提取桑樹葉片、對照植株葉片的DNA，分別作為PCR反應的模板。根據GUS基因核苷酸序列設計一對引物（GusF：5‘-CGT CCT GTA GAA ACCCCA ACCC-’；GusR：5‘-ATGCCATGTTCATCTGCCCAGT-3’）。根據KOD-Plus-Neo（TOYOBO公司，日本）酶說明，配制PCR反應體系，反應程序：94℃預變性4 min后，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s。共循環35次。PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀察、拍照。

回收瓊脂糖凝膠上對應大小的特異性條帶，并委托上海鉑尚生物技術公司進行測序檢測。

1.6 冬芽處理組桑果的檢測

采摘冬芽處理枝條上結出的桑果，收集桑種子并烘干。用100 g·L-1次氯酸鈉對桑籽進行消毒處理［19］后播種于含 100 mg·L-1的Kan 1/2 MS 培養基上。觀察并統計種子的萌發情況

1.7 數據分析

利用SPSS的平均數單因素方差分析方法，對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 桑樹冬芽的轉化

以萌動期桑樹72C002的冬芽為研究對象（圖1A），經70%酒精擦拭消毒后，每個冬芽注射重組農桿菌0.1 ml（圖1A，1B）。一周后，觀察芽尖開始轉綠（圖1C）；繼續觀察至第三周時，芽尖上新葉長大，開始逐漸伸展張開。這時觀察到由于受注射農桿菌的影響，葉片葉尖和部分有萎黃卷曲表型出現（圖1D）。

圖1 注射浸染桑樹冬芽及芽頭早期的生長Figure 1 Progress of mulberry winter bud injection and its initial growth

2.2 PCR擴增檢測

冬芽處理8周后，隨機從6個冬芽生長的枝條上采葉片，抽提取樣品DNA后，利用GUS基因特異性引物進行擴增。從PCR的擴增產物電泳結果（圖2）可知，有四組樣品擴增到預計大小條帶，另外2個處理后的葉片樣品僅擴增得到非特異性的雜帶；同時，正常未處理對照植株來源的葉片樣品檢測，擴增均未獲得與GUS基因大小相對應的片段。擴增產物純化后送鉑尚公司測序，證實擴增序列與目標基因GUS一致。

圖2 轉基因桑樹葉片的PCR擴增檢測Figure 2 PCR measurement of the leaves of transgenic mulberry

圖3 轉基因桑樹葉片和果實的GUS染色觀察Figure 3 GUS staining of the leaves and fruits from transgenic mulberry tree

圖4 轉基因桑樹種子的抗性篩選Figure 4 Resistance selection of transgenic mulberry seeds

2.3 冬芽處理枝條的GUS酶活性檢測

隨機選取20個注射冬芽長出的枝條，分別采集靠近枝頂端已經完全張開的葉片，進行GUS染色。其中有9個枝條上葉片呈現出GUS酶著染的藍色結果，主要顯示在葉片葉脈附近（圖3A，3B）。

采摘不同冬芽枝條上結的桑果10個進行GUS酶活性染色，在其中2個桑果上觀察到GUS的表達主要在果柄和部分果肉細胞（圖3C，3D）。

2.4 桑籽的抗性篩選

采集GUS染色陽性10個枝條上的桑果，同一冬芽來源的枝條上的桑果混合在一組，流水反復沖洗收集桑籽后，將采集好的桑籽置于30℃烘箱烘干。經消毒后散播在含100 g·L-1卡那霉素的1/2 MS培養平板上，25℃恒溫培養10天。結果發現不同組間發芽率（圖4）從0～16.67%不等，平均7.61%，組間偏差極顯著（P＜0.01）。

3 討論

目前，非轉基因的桑樹育種方法在生產應用廣泛，人們利用這些傳統的雜交、嫁接、多倍體誘導等技術，已選育出很多性能優良的實用化品種。但為了加快品種選育速度，提高選育的針對性，桑樹轉基因技術的探索一直備受關注［14］。本研究中，我們采用注射方法將重組農桿菌導入桑樹冬芽，對轉基因桑樹的GUS酶活性染色、特異性外源基因片段的擴增和抗性篩選檢測外源基因已經進入轉基因桑樹（圖2～4），GUS陽性檢測率達45%；抗性篩選獲得的轉基因種子萌發率平均為7.61%。但研究還同時發現，GUS染色檢測陽性率與基因組DNA進行的PCR反應率間陽性率不一致，推測這可能與檢測樣本間差異以及檢測方法的靈敏度不同有關。

本研究針對不同轉化枝條獲得桑籽的抗性篩選發芽率差異較大（圖4），已發芽的幼苗葉片抽提基因組DNA進行的PCR反應卻未擴增到靶片段。分析可能與樓程富等［20］研究提出的未經愈傷處理的新芽組織很難被T-DNA整合有關，因為農桿菌很難穿過角質層和排列緊密有序的表皮細胞去完成貼壁反應。Machii等［21］1996年利用基因槍轟擊桑樹懸浮愈傷組織，研究檢測到GUS陽性，但最終并未能獲得轉基因植株。

在農桿菌浸染桑樹品種的選擇上，已報道的桑樹轉基因主要有新一之瀨、豐馳桑、白桑M5［3］、印度桑 K2［14，16］，不同桑樹品種的遺傳轉化適應性存在差異；縱使在組織培養時，我們前期研究也發現適合川桑、滇桑、藥桑、印度桑無菌幼苗莖段和生根培養體系存在差異，并且培養基中激素濃度小幅變化都會對其繁殖系數造成明顯影響［22］。這些都提示今后可以利用更多的桑樹品種來進一步優化轉化體系；但本研究方法操作簡單，這對今后桑樹實用品種的遺傳研究具有意見借鑒參考意義。