電化學發光法高靈敏檢測左氧氟沙星

李哲建，樊雪梅，王書民

（商洛學院化學工程與現代材料學院/陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室，陜西商洛 726000）

左氧氟沙星[1]（LVFX）系第三代喹諾酮類抗生素，對細菌、支原體及部分厭氧菌有效，廣泛應用于臨床系統感染，服用不當或長期使用，會出現過敏反應、中樞神經反應等不良反應，致病菌易產生耐藥性，因此檢測左氧氟沙星具有重要意義。目前測定左氧氟沙星的方法有紫外光譜法[2-3]、熒光光譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、毛細管電泳法[8]、電化學發光分析法[9]以及化學發光法[10]等，但這些方法存在操作復雜、靈敏度較低、動態范圍窄、操作繁瑣等缺點。因此，建立一種檢測左氧氟沙星的新方法十分必要。電化學發光（ECL）技術具有高靈敏度、寬動態范圍、易操作、可控的電位性等優點[11]。聯吡啶釕/Nafion/AuNPs(Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs)復合膜在電化學發光分析技術的應用研究中在很短時間內得到了迅速發展。原因在于Nafion是一種離子交換型聚合物，具有很高的抗化學侵蝕性質和成膜性質，金納米粒子良好的導電性和較大的比表面積[12]，這樣Nafion/AuNPs復合物就能夠穩定有效的固定Ru(bpy)32+，從而有效確保Ru(bpy)32+電化學發光的超強穩定性，提高了分析檢測效率。本文利用Nafion/AuNPs復合膜包埋穩定Ru(bpy)32+的固定技術，實現了Ru(bpy)32+高效穩定的固定，成功組裝在修飾電極表面，制備出Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE修飾電極，利用該修飾電極對左氧氟沙星的電化學發光性能進行研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

左氧氟沙星注射液（0.2 g，100 mL，石家莊四藥有限公司），左氧氟沙星結構式見圖1。釕聯吡啶化合物Ru(bpy)32+，Nafion（全氟代磺酸脂），氯金酸和檸檬酸鈉購自Sigma公司；三丙正胺（Tri-n-propylamine，簡稱 TPrA）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀均購自國藥集團化學試劑有限公司。磷酸鹽緩沖溶液（PBS），用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制；其它所用化學試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

圖1 左氧氟沙星的結構式

透射電子顯微鏡（TEM）（JEOL，JEM-2100，日本）；電化學發光檢測全程使用MPI-E型電化學發光儀（西安瑞邁電子公司）。電化學發光采用傳統的三電極系統，工作電極是玻碳電極（直徑2.0 mm）及修飾電極，參比電極為裝有飽和KCl溶液的Ag/AgCl電極，對電極是鉑片電極。-600 V設為檢測時光電倍增管（PMT）的高壓。電化學測量過程使用CHI 660D電化學工作站（上海辰華儀器公司）。pHS-25型pH計購于上海雷磁儀器廠；KQ-100B型超聲波清洗器購于昆山超聲儀器有限公司。

1.2 裸電極預處理

直徑2 mm的玻碳電極用粒徑為0.3 μm和0.05 μm的Al2O3泥漿中打磨拋光，然后依次用體積比1：1的硝酸、無水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗2 min，最后用氮氣吹干備用。

1.3 金納米粒子的制備

根據文獻[12]利用檸檬酸鹽還原法制備金納米粒子。先將氯金酸配制成0.01%的溶液，取50 mL氯金酸溶液加熱至沸騰后再往里面加入1%的檸檬酸三鈉溶液5.6 mL，當看到淡黃色的氯金酸水溶液經灰色、黑色、紫色的顏色變化，最終變為紅色時，繼續加熱和攪拌12 min后，停止加熱，然后繼續攪拌溶液15 min后至溶液呈室溫。最后，將該溶液轉入棕色試劑瓶中于4℃保存備用。

1.4 AuNPs/Nafion/GCE修飾電極的制備

將制備好的納米金分散于Nafion中，于高速混合儀上混合20 min，制得Nafion/AuNPs懸浮液。取10 μL AuNPs/Nafion混合后的懸浮液均勻滴到預先處理干凈的玻碳電極表面，在空氣中自然晾干，待電極表面形成一層均勻的薄膜后，即得AuNPs/Nafion/GCE修飾電極。

1.5 電化學發光傳感器的制備

滴加AuNPs/Nafion懸浮液到預先處理好的玻碳電極表面，自然晾干后再滴加10 μL Ru(bpy)32+得到Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs修飾的玻碳電極，將該傳感器避光保存于4℃環境下備用。用 0.01 mol·L-1pH=7.4 的 PBS 溶液沖洗電極，除去電極表面多余的Ru(bpy)32+，最終可制得修飾電極Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE，即得電化學發光傳感器。

2 結果與討論

2.1 金納米粒子表征

金納米粒子的透射電鏡分析譜圖見圖2。從圖2中可以看出，制備納米粒子粒徑為納米級的，表面較光滑，形狀為圓球狀，粒徑大約為10 nm。

2.2 實驗方法的可行性

在預先處理好的玻碳電極上滴加 5.0 μL 0.5 mg·mL-1的 Nafion/AuNPs懸浮液，室溫晾干，再滴加 5.0 μL 1.0 ×10-5mol·L-1的 Ru(bpy)32+溶液，室溫晾干備用，形成Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE修飾電極，即為電化學發光傳感器。由于Nafion具有良好的成膜效應，Nafion帶負電和三聯吡啶釕帶正電，二者由于靜電作用相互吸引，使三聯吡啶釕能夠穩定的固定在電化學發光傳感界面上。為了證明該實驗方法的可行性，采用電化學發光技術進行研究。對比了修飾的玻碳電極上存在目標物左氧氟沙星和不存在目標物左氧氟沙星的電化學發光強度。圖3為修飾電極與不同濃度的左氧氟沙星反應后檢測的電化學發光強度。曲線a為不存在左氧氟沙星時，電化學發光強度非常低。曲線b為1.0×10-11mol·L-1的左氧氟沙星與修飾電極結合后的電化學發光強度，電化學發光強度增強。當左氧氟沙星濃度繼續升高為5.0×10-10mol·L-1時，電化學發光強度也顯著增強（如曲線c所示）。這表明隨著溶液中左氧氟沙星的濃度增加電極的電化學發光強度顯著增強。因此，修飾電極Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE可用于檢測左氧氟沙星。

圖2 金納米粒子的TEM圖

圖3 不同濃度左氧氟沙星對電化學發光強度的影響

2.3 雜交時間優化

本文對關鍵實驗參數雜交時間進行了優化，以獲得所制電化學發光傳感器優良性能。圖4為Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE修飾電極與目標物1.0×10-11mol·L-1左氧氟沙星的雜交時間與電化學發光積分值的變化關系圖，從圖4中可以看出在30 min之前電化學發光強度值隨雜交時間的增加急劇增加。到60 min后電化學發光強度趨于穩定，為確保Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE和目標物充分雜交，70 min被選為雜交時間。

圖4 雜交時間對電化學發光強度的影響

2.4 檢測范圍和靈敏度

圖5為相同的修飾電極在不同濃度左氧氟沙星與其對應的電化學發光強度，圖5分析研究了電化學發光傳感器與不同濃度左氧氟沙星相互作用，在此實驗條件下對左氧氟沙星進行了定量檢測。由圖5可以可知，當左氧氟沙星的濃度不斷增大時，電化學發光強度也越強，同時也可以驗證出左氧氟沙星對聯吡啶釕Ru(bpy)32+的電化學發光信號有較強的增敏作用。圖6為不同濃度的左氧氟沙星與其在修飾電極上電化學發光強度的校準曲線，結果表明，隨著左氧氟沙星溶液濃度的不斷增大，電化學發光強度值也不斷增大。以三次平行測量左氧氟沙星所得電化學發光強度的平均值對左氧氟沙星濃度的對數作圖在5.0×10-12～1.0×10-9mol·L-1的濃度范圍內，電化學發光的強度與其左氧氟沙星的濃度呈良好的線性關系， 線性方程為I=1.634×106+1.36×105logC，線性相關系數R=0.994 3，檢出限(S/N=3)為3.0×10-12mol·L-1。結果表明,相對于電化學發光法[9]和化學發光法[10]具有較高的靈敏度和較低的檢出限。而且無需加入雜交指示劑，使操作程序大大簡化。

2.5 傳感器的重現性和貯存穩定性

通過研究5支按相同方法制備的修飾電極與同一濃度（1.0×10-10mol·L-1）的左氧氟沙星雜交前后電化學發光強度的變化值來考察傳感器的重現性，5支電極測定結果的RSD為5.2%。結果表明，該電化學發光傳感器測定左氧氟沙星有良好的重現性。構制的傳感器不用時4℃下于PBS中避光保存。在15 d后,考察修飾電極Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE 傳感器對 1.0×10-10mol·L-1的左氧氟沙星的響應情況，結果顯示，電化學發光信號強度值保持穩定，該穩定性實驗說明所構建的傳感器具有良好的貯存穩定性。

圖5 電化學發光強度與左氧氟沙星濃度間的線性關系

圖6 電化學發光強度差值與左氧氟沙星濃度的校準曲線

3 結論

本文以三聯吡啶釕為信號物質，以左氧氟沙星為目標檢測物質，以金納米粒子作為放大信號物質，構制了一種高靈敏測定藥物的電化學發光傳感器。因為金納米粒子良好的導電性和較大的比表面積，導致電化學發光信號聯吡啶釕的具有增大的氧化還原電流，所以導致電化學發光信號也有很大增強。該傳感器具有制作簡單，檢測速度快等優點，從而為DNA雜交傳感器的設計、以及藥物的檢測提供了有益借鑒。