菜用大豆耐鹽品種資源鑒定及其耐鹽生理機理研究

李超漢,楊紅娟?,高亞達,朱麗華,宋榮浩,顧衛紅??

（1上海市農業科學院園藝研究所∕上海市設施園藝重點實驗室,上海201106;2上海農林職業技術學院,上海201600;3上海市農業科學院生態環境保護研究所,上海201403）

我國鹽漬土分布廣泛,鹽堿土的總面積超過9000萬hm2[1],且受全球溫室效應、環境污染和化肥施用不當等因素影響,土壤鹽漬化日趨嚴重[2],農業可持續發展受到嚴重威脅。鹽脅迫作為最嚴峻的環境脅迫之一,不僅影響植物水分吸收,還協同Na+和Cl-毒害致使葉片失綠、生物量降低,嚴重時導致死亡[3]。作物耐鹽新品種的培育是開發利用鹽漬土壤,推進鹽堿地區農業產業發展,提高社會效益和經濟效益的最有效、最環保的方法。

菜用大豆[Glycine max（L.）Merrill]俗稱毛豆,是指豆莢處于鼓粒盛期至初熟期即采收作為蔬菜的大豆類型,其營養豐富、味道鮮美,是我國和東南亞國家居民喜食的傳統特色蔬菜。我國菜用大豆地方品種資源十分豐富,但是,不同大豆品種對鹽脅迫的耐受性存在著較大的差異。為從大豆種質資源中挖掘鑒定耐鹽種質,邵桂花等[4]利用電導率15—17 mS∕cm的咸水灌溉大田,從1716份大豆資源中篩選到一批耐鹽品種和鹽敏感品種。王聰等[5]利用苗期致死濃度從15份菜用大豆品種篩選出2個耐鹽品種以及2個鹽敏感品種。劉光宇等[6]通過水培法,利用100 mmol∕L NaCl溶液模擬鹽脅迫鑒定了29份大豆的耐鹽性。張玉梅等[7]也利用NaCl致死濃度從244份野生大豆中鑒定到一批苗期耐鹽種質資源。本研究對收集純化的10份崇明島地方菜用大豆品種[8]、3個引進常規品種以及4個自選育品種（種質）的發芽期和苗期耐鹽性進行鑒定,并對其中10個品種進行結莢期耐鹽性鑒定,旨在為菜用大豆耐鹽品種的選育和耐鹽機理的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共選取了17份菜用大豆品種資源,包括10份從上海市崇明島搜集純化的地方菜用大豆品種資源‘黃牛踏扁’‘青牛踏扁’‘粗八月白’‘細八月白’‘骨粒青’‘烏大青’‘烏毛豆’‘綠皮豆’‘小安黃’和‘五早豆’,本課題組選育的4個菜用大豆新品種（種質）‘青酥五號’和‘VS13-2’‘VS11-5’和‘Z-7-5’,以及引進搜集的3個菜用大豆品種‘蘇鮮四號’‘浙鮮豆五號’和‘八月白’。

1.2 試驗方法

1.2.1 發芽期耐鹽性鑒定

2016年2月16日對上述17個品種進行發芽期鹽脅迫。以150 mmol∕L和200 mmol∕L NaCl溶液模擬鹽脅迫,以清水為對照（CK）,每品種每處理選取100粒籽粒飽滿、均勻一致的種子置于放有雙層濾紙的培養皿中,3次重復。每個培養皿加NaCl溶液或清水20 mL,在25℃恒溫箱中發芽。處理第2天在每個培養皿分別補充NaCl溶液或清水5 mL,隨后每天補充3 mL,以保持發芽所需的水分。發芽6 d后,統計各品種的發芽率、發芽率-鹽害率、胚根長度和胚根長-鹽害率。發芽率=發芽種子數∕供試種子數×100%;發芽率-鹽害率 =[發芽率（CK）- 發芽率（鹽脅迫）]∕發芽率（CK）×100%;胚根長-鹽害率 =[胚根長（CK）- 胚根長（鹽脅迫）]∕胚根長（CK）×100%。

1.2.2 苗期耐鹽性鑒定

2016年3月30日對上述17個品種進行苗期鹽脅迫。挑選飽滿均勻的種子播種于裝有普通育苗基質（草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1）的花盆（直徑11 cm,高12 cm）中,每盆播12粒,每個品種播種18盆。試驗在塑料大棚里進行,種子發芽后,正常水分管理,待子葉展開、對生真葉露出后間苗,每盆留長勢較一致的幼苗5—6株。對生真葉完全展開后,鹽脅迫分別澆灌150 mmol∕L和200 mmol∕L NaCl溶液,對照澆清水,每品種每處理6盆,將相同處理的花盆放置在一個底部不透水的塑料盆中（長×寬×高為50 cm×36 cm×10 cm）。每次每盆澆灌200 mL,每隔1 d澆1次,共澆灌6次。鹽脅迫10 d后,測定各個品種的株高和葉綠素含量,并計算鹽害率,鹽害率計算公式參照發芽率-鹽害率等。葉綠素含量的測定參照李合生等[9]的方法。

1.2.3 結莢期耐鹽性鑒定

2016年8月4日選取10個品種進行結莢期耐鹽性鑒定,挑選飽滿均勻的種子種于裝有普通栽培基質（草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1,每盆添加顆粒緩釋肥15 g）的花盆（口徑28 cm,底徑23 cm,高20 cm）中,每個花盆種10粒,每個品種6盆。試驗在塑料大棚里進行,種子發芽后,正常水分管理。幼苗第一片三出葉展平時間苗,每盆留苗2株。分別在每個品種的盛花期用150 mmol∕L NaCl溶液進行鹽脅迫,以澆清水為對照,鹽脅迫和對照各3盆,每次每盆澆灌2 L,每隔1 d澆1次鹽溶液,脅迫20 d。在各個品種的籽粒初熟期測定其有效分枝數、株高、單株莢數、產量及鮮籽粒百粒重,并計算相應的鹽害率,鹽害率計算公式參照發芽率-鹽害率等。

1.2.4 菜用大豆苗期耐鹽生理特性

2016年10月21日選耐鹽性不同的4個品種‘浙鮮豆五號’‘VS13-2’‘蘇鮮四號’和‘烏大青’進行苗期耐鹽生理特性分析。采用育苗基質栽培,選取飽滿的種子播種于高12 cm、直徑11 cm的花盆中,每盆播12粒,每個品種30盆,每6盆放置在一個底部不透水的塑料盒中。正常水分管理,待子葉完全展開后,每盆選留長勢一致的幼苗6棵。對生真葉展開時,每盆澆200 mmol∕L NaCl溶液200 mL,對照澆清水,鹽脅迫和對照處理各15盆,每隔1 d澆1次。在鹽脅迫第0、2、5、9、12天分別采取葉片,每次采集3盆,液氮速凍后存于-80℃冰箱中。樣品用于測定SOD、ROD、CAT活性,可溶性蛋白含量及MDA含量。采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[9];過氧化物酶（ROD）活性測定參照陳建勛等[10]的方法;過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測定[11];可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[9];丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定[9]。

1.3 數據分析

采用Excel 2010軟件處理數據,用t-test進行成對顯著性分析。采用DRS數據分析軟件的“Duncan新復極差法”進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菜用大豆發芽期耐鹽性的鑒定

由表1可知,正常條件下不同品種間的發芽率有較大的差異,鹽脅迫抑制了所有品種的發芽。150 mmol∕L NaCl處理6 d后,‘綠皮豆’和‘VS11-5’受鹽害程度均超過32%,‘烏大青’和‘青酥五號’的鹽害率分別為24.64%和24.34%;而‘五早豆’‘蘇鮮四號’‘黃牛踏扁’‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’受鹽害程度較低,分別為0.43%、2.22%、3.61%、4.51%和4.83%。200 mmol∕L NaCl處理6 d后,‘蘇鮮四號’‘青酥五號’‘綠皮豆’和‘烏大青’的鹽害率分別高達57.32%、50.60%、47.78%和45.05%;而‘骨粒青’‘VS13-2’‘五早豆’和‘浙鮮豆五號’受鹽害程度較低,分別為5.26%、5.21%、6.25%和12.37%。

表1 鹽脅迫對菜用大豆發芽率的影響Table 1 The effects of salt stress on germination rate of vegetable soybean cultivars

由表2可知,在正常條件下發芽6 d后,菜用大豆不同品種之間的胚根長度存在明顯差異。150 mmol∕L NaCl處理6 d后,‘青牛踏扁’和‘粗八月白’受鹽害程度較輕,分別為17.85%和22.60%,‘蘇鮮四號’和‘浙鮮豆五號’的鹽害率分別為33.59%和33.80%,其余大多數品種的胚根伸長受阻嚴重,鹽害率超過50%。200 mmol∕L NaCl處理6 d后,僅‘粗八月白’和‘青牛踏扁’的鹽害率較低,分別為42.88%和46.74%,其余品種胚根伸長受到嚴重抑制,鹽害率為60%—80%。根據鹽脅迫對菜用大豆的發芽率（表1）和胚根長度（表2）的影響,綜合篩選獲得了發芽期耐鹽性較強的品種‘骨粒青’‘VS13-2’‘浙鮮豆五號’和‘青牛踏扁’,鹽敏感品種‘烏大青’‘綠皮豆’‘蘇鮮四號’和‘VS11-5’。

表2 鹽脅迫對菜用大豆胚根長度的影響Table 2 The effects of salt stress onradicle length of vegetable soybean cultivars

2.2 菜用大豆苗期耐鹽性的鑒定

由表3可知,與CK相比,17個品種的株高在不同程度上均受到了鹽脅迫的抑制。150 mmol∕L NaCl處理10 d后,‘小安黃’‘綠皮豆’‘青牛踏扁’‘黃牛踏扁’‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’受到鹽害的程度較輕,鹽害率分別為4.39%、7.41%、7.91%、7.97%、8.08%和8.15%;而‘烏毛豆’‘粗八月白’‘蘇鮮四號’和‘骨粒青’的株高受抑制程度較重,鹽害率達到36.13%、19.01%、16.87%和15.91%。200 mmol∕L NaCl處理10 d后,‘烏毛豆’‘蘇鮮四號’‘VS11-5’‘VS13-2’和‘綠皮豆’的鹽害率分別高達35.62%、30.66%、27.62%和26.88%;而‘青牛踏扁’‘小安黃’和‘細八月白’受鹽害程度較低,鹽害率分別為13.53%、16.67%和18.14%。

表3 鹽脅迫對菜用大豆株高的影響Table 3 The effects of salt stress on plant height of vegetable soybean cultivars

由表4可知,與CK相比,17個品種的葉綠素含量在鹽脅迫10 d后均有不同程度的降低。150 mmol∕L NaCl處理10 d后,‘青牛踏扁’‘烏大青’‘粗八月白’和‘蘇鮮四號’受鹽害程度高,葉綠素含量明顯降低,鹽害率分別高達13.01%、9.99%、9.28%和9.20%,而‘骨粒青’‘浙鮮豆五號’和‘烏毛豆’的鹽害率較低。200 mmol∕L NaCl處理10 d后,‘青牛踏扁’‘烏大青’‘八月白’和‘粗八月白’的鹽害率分別高達15.31%、13.83%、13.72%和12.91%,而‘浙鮮豆五號’‘烏毛豆’和‘骨粒青’受鹽害程度較輕。因此,綜合考慮各品種在鹽脅迫10 d后的株高和葉綠素含量的變化,鑒定獲得苗期耐鹽性品種‘浙鮮豆五號’‘五早豆’‘骨粒青’和‘VS13-2’,鹽敏感品種‘烏大青’‘蘇鮮四號’和‘黃牛踏扁’。

表4 鹽脅迫對菜用大豆葉片中葉綠素含量的影響Table 4 The effects of salt stress on chlorophyll content in leaf of vegetable soybean cultivars

2.3 菜用大豆結莢期耐鹽性鑒定

由表5可知,150 mmol∕L NaCl脅迫20 d后,10個品種的株高和有效分枝數均有不同程度的減少,以‘蘇鮮四號’‘烏大青’和‘青牛踏扁’受鹽害程度較重,‘骨粒青’‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’受鹽害程度較輕。由表6可知,鹽脅迫20 d后,各品種的單株莢數、產量和鮮籽百粒重也有不同程度的降低,其中,‘細八月白’‘VS13-2’‘骨粒青’和‘浙鮮豆五號’的鹽害率較低,而‘烏大青’‘蘇鮮四號’‘綠皮豆’和‘五早豆’的鹽害率較高。

表5 鹽脅迫對菜用大豆生長的影響Table 5 The effects of salt stress on plant growth of vegetable soybean cultivars

綜合評價各品種發芽期、苗期及結莢期的耐鹽性,鑒定得到3個耐鹽品種‘浙鮮豆五號’‘VS13-2’和‘骨粒青’,3個鹽敏感品種‘烏大青’‘蘇鮮四號’和‘綠皮豆’。

2.4 鹽脅迫對菜用大豆苗期葉片抗氧化酶系統的影響

對‘浙鮮豆五號’‘VS13-2’‘蘇鮮四號’和‘烏大青’進行苗期鹽脅迫。由表7可知,‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’的ROD活性在鹽脅迫2 d和5 d顯著高于CK,12 d后又顯著降低;‘蘇鮮四號’和‘烏大青’的ROD活性在鹽脅迫5 d時顯著高于CK,9 d和12 d又顯著降低。鹽脅迫下,‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’的ROD活性明顯高于‘蘇鮮四號’和‘烏大青’,以‘浙鮮豆五號’的ROD活性最高。與CK相比,‘浙鮮豆五號’的CAT活性在鹽脅迫2 d和5 d時顯著升高,而‘VS13-2’的CAT活性在鹽脅迫5 d、9 d和12 d時顯著降低,‘蘇鮮四號’和‘烏大青’的CAT活性在鹽脅迫2 d時顯著升高,在5 d和9 d時又顯著降低。‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’的CAT活性在鹽脅迫5 d、9 d和12 d時明顯高于‘蘇鮮四號’和‘烏大青’。與CK相比,這4個品種的SOD活性在鹽脅迫早期變化不明顯,在9 d和12 d后顯著降低。‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’在鹽脅迫9 d和12 d時明顯高于‘蘇鮮四號’和‘烏大青’。

表6 鹽脅迫對菜用大豆鮮莢產量的影響Table 6 The effects of salt stress on fresh pod yields of vegetable soybean cultivars

表7 鹽脅迫對菜用大豆葉片抗氧化酶（POD、CAT、SOD）活性、可溶性蛋白和MDA含量的影響Table 7 The effects of salt stress on activities of POD,CAT and SOD,on contents of soluble protein and MDA in leaf of vegetable soybean cultivars

由表7還可以看出,與CK相比,這4個品種的可溶性蛋白含量在鹽脅迫2 d與5 d時顯著增加,隨著脅迫時間的延長又有不同程度的降低,在12 d后明顯低于CK。鹽脅迫下,‘VS13-2’的可溶性蛋白含量高于‘浙鮮豆五號’‘蘇鮮四號’和‘烏大青’。此外,這4個品種的MDA含量隨著鹽脅迫的進行明顯高于對照。鹽脅迫下,‘蘇鮮四號’和‘烏大青’的MDA含量明顯高于‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’,在鹽脅迫12 d時,‘烏大青’的MDA含量最高,‘蘇鮮四號’次之。

3 討論與結論

植物的耐鹽性評價指標可以綜合為兩類:一類是表型指標,即生長指標,包括鹽害指數、生物量和產量等;另一類是生理指標,主要包括Na+和Cl-等鹽離子的含量與分布、細胞質膜透性及抗氧化酶活性等。大豆屬陸生植物,本試驗利用普通栽培基質培育菜用大豆,澆灌NaCl溶液模擬鹽脅迫,此方法與水培[6-7,12]或蛭石栽培[8,13]相比,更接近菜用大豆的實際生長環境,能更好地反映植株在鹽堿地的生長狀態,且操作簡便、易于管理。本研究利用150 mmol∕L和200 mmol∕L NaCl溶液對17個菜用大豆品種進行發芽期和幼苗期耐鹽性鑒定,并以單株有效分枝數、鮮莢產量和鮮籽粒百粒重為指標,鑒定了其中10個品種的結莢期耐鹽性。綜合評價篩選出3個耐鹽品種‘浙鮮豆五號’‘VS13-2’和‘骨粒青’,3個鹽敏感品種‘烏大青’‘蘇鮮四號’和‘綠皮豆’,為篩選創制菜用大豆耐鹽種質和探討耐鹽機理奠定了良好的物質基礎。

在正常條件下,植物體內活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的產生與清除處于動態平衡狀態。當植物遭遇鹽脅迫時,動態平衡會被打破,導致膜質過氧化、葉綠素降解,甚至植株死亡[3,14-15]。大豆遭遇鹽脅迫時,可以通過調節Na+的吸收和轉運[15-17]以及Cl-的排出[18-19]來降低植株地上部Na+和Cl-的含量,也可以利用活性氧清除系統來清除ROS,減少細胞膜系統的損傷[8,15,20-21]。本試驗對篩選出的耐鹽品種‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’及鹽敏感品種‘蘇鮮四號’和‘烏大青’進行苗期鹽脅迫,結果表明:‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’能夠迅速響應鹽脅迫,維持較高的ROD和CAT等抗氧化酶活性,使ROS的產生和清除維持在一個相對較穩定的狀態,降低細胞膜質的過氧化速度,減緩MDA含量的積累,從而減少ROS對細胞的傷害,進一步從生理角度說明‘浙鮮豆五號’和‘VS13-2’的耐鹽性較強。