同步檢測動物源性成分的四重PCR的條件優化和檢出限分析

王金斌,李 文,郭陳莉,白 藍,3,劉 華,3,吳文惠,唐雪明??

（1上海市農業科學院,上海201106;2上海海洋大學食品學院,上海200090;3上海市農業遺傳育種重點實驗室,上海201106）

近幾年,國內外曝光了多起影響比較大的肉類摻假事件,如歐洲的“馬肉風波”、國內的假牛肉事件等。隨著食品品種的豐富和摻假手段的提高,對食品摻假的鑒定技術提出了更高的要求,尤其是快速、高通量鑒別技術[1]。

目前的動物物種鑒別方法主要基于蛋白質和DNA分析。其中,在DNA分子水平上以聚合酶鏈反應（RCR）為基礎的技術已逐步成為食品中肉類動物源性成分鑒定的核心方法[2]。目前,以檢測DNA為基礎的方法主要有:常規RCR-凝膠電泳法[3]、多重RCR-凝膠電泳法[4]、隨機擴增多態性DNA分析（RCRRARD）[5]、長度多態性分析（RCR-RFLR）[6]、DNA 條形碼（DNA barcoding）[7]、熒光定量 RCR[8]、微滴數字RCR方法[9]等。在這些技術中,由于常規RCR-凝膠電泳法具有簡便、準確、靈敏等優點,在實際檢測中的應用最廣泛。科研人員根據不同物種基因序列的差異位點設計不同動物源性的特異性引物,靶基因來源于細胞核DNA和線粒體DNA。其中,細胞核DNA主要有SINE區域、環狀GMR磷酸二酯酶基因、白細胞介素-2（IL-2）的前體基因、皮質素受體1（MC1R）基因、肌肉生長抑制素基因、18S rRNA、生長激素基因;線粒體DNA主要有COI基因、細胞色素b基因、12S rRNA、D環區域、ND5、ND2基因、ATRase6∕ATRase8基因和16S rRNA基因等。在目標基因選擇方面,動物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性,且拷貝數多,在食品加工過程未完全降解,因此其多態性位點是設計肉類成分定性檢測的首選靶點[2]。在方法設計方面,同一反應體系中加入多對引物的多重RCR技術應用于食品中動物源性成分的鑒別,可提高檢測效率與檢測通量[10]。Matsunaga等[11]首次進行了多重RCR的研究,通過分析細胞色素b基因研究了牛、豬、山羊、雞、綿羊、馬的四重RCR,并得出檢測限為25 ng DNA。近幾年,大量研究報道了在同一 RCR反應體系里加入多對引物同時檢測牛、豬、驢、山羊、綿羊、禽類等多種肉類成分的多重RCR鑒定方法。如Kitpipit等[5]用豬、雞、馬、牛、鴕鳥肉和山羊進行了六重RCR的研究,其分析目標是 Cyt b、COI和12S rRNA基因,檢測靈敏度可達到12500線粒體拷貝（相當于7×10-15g）。

基于常規定性RCR和實時熒光RCR的檢測技術已經越來越不能勝任一次處理幾種甚至十幾種動物源肉制品的特殊需要,特別是當下大批量的加工產品進入商品化生產,提高檢測方法的效率與通量對于肉類食品安全的及時監管十分重要。基于以最少的工作量達到最佳的檢測效果策略,多重RCR檢測方法可有效提高檢測方法的效率[12]。影響多重RCR結果準確性的因素很多,并非將多對特異性引物簡單混合在同一反應體系就可以進行多重RCR擴增[13]。因此,需要探索最佳反應條件并分析方法的檢出限,這是多重RCR方法建立的前提和基礎。本研究根據牛、羊、豬、雞4種動物源性成分的特異性引物及擴增片段大小,優化RCR體系和擴增條件,旨在建立用于同步檢測牛、羊、豬、雞動物源性成分的四重RCR方法,為肉制品中牛、羊、豬、雞4種動物源性成分的快速檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

牛肉、羊肉、豬肉、雞肉均購于上海隴上農貿市場。TaKaRa Taq DNA聚合酶購于上海皓嘉科技發展有限公司。其他常用化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物序列及合成

本試驗采用的不同動物源性成分特異性引物（表1）來源于動物線粒體基因,由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 動物源特異性引物序列和PCR擴增產物的大小Table 1 The sequence of animal derived specific primers and the length of the PCR products

1.2.2 肉制品中總DNA的提取及混合DNA模板的制備

應用十六烷基三甲基溴化銨從樣品中提取細胞的總DNA（CTAB法）[17]。所提取的DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳進行定性檢測,并觀察其條帶亮度。將100 ng∕μL的4種DNA單模板等量混合作為混合模板。

1.2.3 多重RCR擴增條件的預試驗

多重 RCR 反應體系采用 50 μL 體系:反應緩沖液（10 × ）5 μL,dNTR（2.5 mmol∕L）4 μL,MgCl2（2.5 mmol∕L）3 μL,TaqDNA 聚合酶（5 U∕μL）1 μL,每種引物的正向和反向特異性引物（10 μmol∕L）各1 μL,模板 4 μL,用 ddH2O 補齊。

多重RCR反應條件:95℃預變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火45 s,72℃延伸30 s,共40個循環,最后72℃延伸5 min,4℃保存。擴增后的RCR產物取6 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像系統觀察結果并拍照。

1.2.4 多重RCR擴增條件的優化

為使多重RCR體系中各對引物都能得到高效擴增,主要從各動物源特異性引物的濃度、RCR反應的退火溫度、退火時間等進行單因素優化試驗,以達到提高擴增效率的目的。

1.2.4.1 引物濃度的優化

在預試驗的基礎上,引物濃度分別設置為①牛、羊和雞源特異性引物濃度為0.20 μmol∕L,豬源特異性引物優化濃度梯度為 0.20 μmol∕L、0.16 μmol∕L、0.12 μmol∕L、0.08 μmol∕L;②牛和羊源特異性引物濃度均為0.20 μmol∕L,豬源特異性引物的濃度為 0.08 μmol∕L,雞源特異性引物優化濃度梯度為0.20 μmol∕L、0.16 μmol∕L、0.12 μmol∕L、0.08 μmol∕L;③羊源特異性引物濃度為 0.20 μmol∕L,豬和雞源特異性引物濃度為 0.08 μmol∕L,牛源特異性引物優化濃度梯度為 0.20 μmol∕L、0.16 μmol∕L、0.12 μmol∕L、0.08 μmol∕L;④4組動物源特異性引物濃度等倍增加。梯度1:羊源特異性引物濃度為0.20 μmol∕L,牛、豬和雞源特異性引物濃度為0.08 μmol∕L;梯度2:羊源特異性引物濃度為0.30 μmol∕L,牛、豬和雞源特異性引物濃度為0.12 μmol∕L;梯度3:羊源特異性引物濃度為0.40 μmol∕L,牛、豬和雞源特異性引物濃度為0.16 μmol∕L;梯度 4:羊源特異性引物濃度為 0.50 μmol∕L,牛、豬和雞源特異性引物濃度為 0.20 μmol∕L。

1.2.4.2 退火時間對四重RCR反應擴增效率的影響

在引物濃度優化結果的基礎上,對退火時間進行優化,退火時間分別設置為45 s、50 s、60 s、70 s。

1.2.4.3 退火溫度對四重RCR反應擴增效率的影響

在退火時間優化結果的基礎上,對退火溫度進行優化,退火溫度分別設置為52.0℃、54.0℃、56.0℃、58.0℃、60.0℃和62.0℃。

1.2.4.4 循環次數對四重RCR反應擴增效率的影響

在退火溫度優化結果的基礎上,對循環次數進行優化,循環次數分別設置為35、40、45、50。

1.2.5 優化后四重RCR擴增效果

在單因素優化結果的基礎上,在優化的體系和條件下再次進行引物之間相互影響的試驗,觀察優化的效果。

1.2.6 檢測靈敏度試驗

將100 ng∕μL的4種DNA單模板等量混合作為混合模板,進行10倍梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4,使用優化的反應體系及反應條件考察四重RCR方法的靈敏度。

1.2.7 市售樣本的實際檢測

使用優化的四重RCR方法對市售的20份各類肉制品進行鑒定,并與現行標準方法農業部2031號公告-14—2013（牛）[18]、農業部 2122 號公告-2—2014（羊）[19]、GB∕T 21101—2007（豬源）[20]和 SN∕T 2978—2011（雞）[21]比較確認,驗證方法的實用價值,同時了解市場上肉類摻假的真實狀況。

2 結果與分析

2.1 多重PCR擴增條件的預試驗結果

雖然多重常規RCR能同時檢測幾種動物成分,但在同一反應管中進行多重RCR效果常常會受到很多因素的干擾,導致非特異性的擴增率變大和某些目標分子優先擴增。如圖1所示,當體系中有豬肉、牛肉、雞肉和羊肉提取的4種DNA模板時,單一動物源特異性引物的擴增體系均僅對各自物種的目標片段進行特異性擴增,沒有擴增到其他區域且不會與其他物種起反應。從二重、三重、四重RCR擴增結果可以看出,RCR擴增體系對目標產物之間的影響逐漸變大。在四重RCR產物中,羊源特異性引物擴增效果變化比較明顯,目測不到羊源的特異性條帶。

圖1 四種引物間相互影響的驗證結果Fig.1 Verification results of the interaction among 4 primers

2.2 多重PCR反應條件的優化結果

2.2.1 引物濃度對多重RCR反應擴增效率的影響

如圖2所示,隨著豬源特異性引物濃度減少,其他物種的特異性條帶變強,以觀察到明顯的豬特異性條帶時最低的引物濃度為優化的引物添加量,最終豬源特異性引物濃度優化確定為0.08 μmol∕L（圖2A）;隨著雞源特異性引物濃度減少,其他動物源特異性條帶變強,當雞源特異性引物濃度為0.08 μmol∕L時（圖2B）,仍可以觀察到明顯的雞源特異性條帶;隨著牛源特異性引物濃度減少,其他動物源特異性條帶變強,當牛源特異性引物濃度為0.08 μmol∕L時（圖2C）,仍可以觀察到明顯的牛源特異性條帶,且4種動物源特異性條帶亮度基本一致,因此在接下來的動物源特異性引物濃度優化中等倍增加4種動物源特異性引物添加量;隨著4種動物源特異性引物濃度等倍增加,多重RCR擴增的特異性條帶變強,當羊源特異性引物濃度為0.40 μmol∕L,牛、羊、豬、雞源特異性引物濃度為 0.16 μmol∕L 時（圖 2D）,可以觀察到明顯的4條特異性條帶,繼續等倍增加特異性引物添加量,條帶的亮度變化不明顯,最終確定該組合的特異性引物添加量為優化的動物源特異性引物濃度。

圖2 牛羊豬雞源特異性引物濃度優化結果Fig.2 The optimized results of primers of cattle,sheep,pig and chicken derived ingredients

2.2.2 退火時間對四重RCR反應擴增效率的影響

退化時間的長短與擴增片段大小相關,如圖3所示,退火時間對四重RCR的效果影響不大,為節省時間,選擇45 s作為最終的退火時間。

2.2.3 退火溫度對四重RCR反應擴增效率的影響

退火溫度十分重要,其決定RCR的特異性

和產量。綜合牛、羊、豬、雞鴨源特異性引物的反應特異性與產物量,發現在退火溫度為56℃與58℃的四重RCR的效果最好,考慮RCR儀擴增條件易于在退火溫度與延伸溫度間的轉換,確定四重RCR的最佳退火溫度為58.0℃（圖4）。

2.2.4 循環次數對四重RCR反應擴增效率的影響

如圖5所示,四重反應循環次數在35—50均可充分擴增,且對四重RCR的效果影響不大,考慮到實際樣品獲取的DNA會比本試驗的模板量少,所以確定RCR循環次數為40。

圖3 退火時間的優化結果Fig.3 Optimization results of annealing time

圖4 退火溫度的優化結果Fig.4 Optimization results of annealing temperature

圖5 循環次數優化結果Fig.5 Optimization results of cycle times

2.3 優化后四重PCR擴增效果

如圖6所示,在優化后的四重RCR體系和條件下,豬牛羊雞源4種特異性引物間相互影響降低。與優化前4種引物間相互影響比較,二重、三重、四重RCR均得到了明顯的各個物種的特異性條帶,四重RCR體系和條件優化后的效果非常明顯。

2.4 檢測靈敏度試驗

為了驗證該體系檢測靈敏度,將4種動物基因組DNA模板混合后稀釋10-1、10-2、10-3、10-4進行RCR擴增。將100 ng∕μL牛肉、羊肉、豬肉和雞肉來源的DNA模板原液進行10倍梯度稀釋,每種動物DNA模板濃度為25 ng∕μL。由圖7可見,目標 DNA稀釋103倍后,使用四重RCR法進行檢測,均仍可觀察到明顯的特異性擴增。因此,檢測的靈敏度可達25 pg（10-12g）gDNA。

圖6 優化后豬牛羊雞源4種特異性引物間相互影響的驗證結果Fig.6 Verification results of the interaction among the 4 primers of cattle,sheep,pig and chicken derived ingredients after optimization

圖7 四重PCR靈敏度的檢測Fig.7 The sensitivity of quadruple PCR identification

2.5 市售樣本的實際檢測

從超市購得20種不同的肉制品,用雞、牛、羊、豬普通RCR檢測以及四重RCR檢測體系檢測其中的雞、牛、羊、豬成分。從表2可以看出,四重RCR檢測結果與現行常規RCR檢測標準檢測結果一致,市面上20種肉類產品有9種產品存在著摻假或加工污染的問題,摻假率達45%,主要是用相對便宜的雞肉、豬肉代替牛羊肉。

表2 20份市場樣品的檢測結果Table 2 Test results of 20 market samples

3 討論

在動物源性成分中,多重RCR技術是較為常用的鑒定方法之一。本試驗在參考前人研究的基礎上,基于物種間線粒體基因的序列差異,選擇長度大小相差較大的4種動物源特異性引物,通過優化RCR擴增體系和條件,建立了4種常見肉類成分快速檢測的四重RCR方法。相比于前人鑒別動物源性成分的雙重、三重或四重RCR技術[22-28],本研究應用4對動物源特異性引物同時實現對4種肉類成分的鑒別,大大提高了檢測效率和檢測通量。與Zha等[29]應用多重RCR對野生動物進行鑒定相比,本研究主要針對中國肉類摻假現狀進行研究,具有較顯著的現實意義和應用價值。與熒光RCR和數字RCR方法比較,具有操作簡單、檢測成本節省、檢測通量較高等優點,更適合于對大量肉制品摻假的鑒別篩選。

多重RCR技術實現了對多種動物源性成分的同步檢測,節省時間和成本,是快速檢測動物源性成分的重要研究方向。但多重RCR技術存在一定的問題和缺陷,如多對引物之間的相互抑制,引物與非靶序列的結合產生非特異性擴增。與常規RCR相比,多重RCR是在同一RCR反應體系同時進行多對RCR引物擴增,因此易造成試驗結果靈敏度降低以及對不同目標序列擴增效率不一致等現象,使得相關方法的推廣與標準化受到限制。因此,在多重RCR應用中,優化多重RCR體系及反應條件十分重要,直接關系到檢測結果的特異性與靈敏度。在優化引物濃度時,首先采用等量添加預試驗方案,再進行調整。預試驗的結果會顯示哪些動物成分的特異性條帶明顯或不明顯,從而對優化條件進行設置,使多重RCR得到最佳效果。影響多重RCR反應效果的因素很多,其中引物濃度直接影響RCR擴增的特異性與靈敏度,過高引物濃度易引起錯配,增加非特異性擴增,還易形成引物二聚體,出現條帶彌散或拖尾現象;過低引物濃度易造成擴增產物太少而使條帶過弱或消失[30]。通過引物濃度的優化,確定各動物成分的特異性引物的最優濃度,各特異性條帶亮度得到很大改善。為了進一步提高四重RCR中各特異性引物的擴增效率,分別對反應參數中退火溫度和循環數進行了優化,得到了最佳的反應體系,消除了反應后條帶模糊不清的問題,使之對動物源性成分進行快速、準確、特異的檢測和分析。

考慮到肉制品摻假、摻雜往往是用一種廉價肉類代替或摻入另一種價格相對較高的肉類,因此在針對多種肉類在一個RCR引物體系同時鑒定方面,選取了市場上經常流通的豬、牛、羊、雞4種肉類,大大提高了試驗的實用性。

4 結論

本研究建立了靈敏、可靠的同步鑒別牛、羊、豬和雞等4種肉類成分快速鑒定的四重RCR方法。最佳反應條件為羊源特異性引物對濃度為0.40 μmol∕L,牛源、豬源和雞源特異性引物對濃度為0.16 μmol∕L,退火時間為45 s,退火溫度為58℃,循環數為40。所建四重RCR方法可以一次性檢測牛、豬、羊、雞4種動物源成分,相比于現有標準中的單重RCR技術提高了篩選通量,有效地縮短了檢測時間,加快了檢出速度;相比于實時熒光RCR技術節約了檢測成本。本試驗所建立的方法為牛肉、豬肉、羊肉、雞肉制品的質量控制提供了一種高通量多成分同步檢測的手段。