糯玉米品種‘滬玉糯3號’種子真實性與純度鑒定的SSR核心引物篩選

盧 媛,韓 晴,王義發,沈 淵,沈新芬,瞿玉璣,施 標,沈雪芳?

（1上海市農業科學院作物育種栽培研究所,上海201403;2上海市金山區農業技術推廣中心,上海201599;3上海市青浦區朱家角鎮農業綜合服務中心,上海201713;4上海市農業科學院,上海201403）

近年來,我國種業市場迅速發展,同時也出現了制售假劣種子、種子混雜及套牌侵權等違法行為,造成種子市場的混亂,嚴重侵害農民的利益,影響我國種業的健康可持續發展。因此,加強對玉米雜交種的真實性和純度監管顯得非常必要[1-2]。傳統的表型鑒定工作量大,周期長,深受環境條件影響,不利于種子營銷工作的開展;而同工酶和種子貯藏蛋白鑒定多態率低,重復性差,以上方法均已無法滿足玉米品種真實性和純度鑒定的需要。目前,基于分子標記技術的DNA指紋鑒定技術已成為品種真實性和純度鑒定的重要手段[3-4]。SSR標記具有易分析、多態率高、分布均勻、重復可靠、快速、準確的特點,是目前應用較多的分子標記技術。我國農業部已頒布了利用核心SSR分子標記技術對國家及省區試玉米品種真實性和一致性進行DNA指紋鑒定的行業標準（《NY∕T 1432—2014玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》）。DNA指紋鑒定技術在種子真實性和純度鑒定上的應用,為從源頭上控制玉米品種多、亂、雜現象提供了技術支撐。

‘滬玉糯3號’是由上海市農業科學院選育的擁有自主知識產權的優質、高產鮮食糯玉米品種,于2002年通過上海市審定[滬農品審玉米（2002）第007號]。‘滬玉糯3號’熟期早、產量較對照‘蘇玉糯1號’增產13.6%,品質好,適用于加工,在我國長三角地區推廣面積較廣,市場影響力大。本研究利用40對SSR核心引物,對2個待測品種的真實性進行鑒定,并從中篩選出6對可用于‘滬玉糯3號’純度鑒定的SSR分子標記,同時,建立‘滬玉糯3號’及其親本的DNA指紋圖譜,旨在為加強‘滬玉糯3號’的產權保護及種子質量監測工作提供理論依據和技術保障。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘滬玉糯3號’是以自交系申W48（原名SW48）和申W22（原名SW22）為親本組配的優質、高產糯玉米單交種。選用‘滬玉糯3號’標準品、2個待檢測品種,以及16份糯玉米品種‘滬紫黑糯1號’‘申糯2號’‘佳糯668’‘斯達糯41’‘京科糯656’‘蘇玉糯5號’‘金玉糯9號’‘京科糯609’‘蘇科糯1501’‘天貴糯932’‘大玉糯2號’‘申糯8號’‘晶彩糯’‘浙糯玉10’‘晉糯20號’‘京科糯2000’進行試驗。以上材料由上海市農業科學院玉米遺傳育種課題組提供。

1.2 DNA提取及質量檢測

2016年5月分別在‘滬玉糯3號’、申W48和申W22中各選取20個大小和色澤均勻一致的籽粒在培養皿中培育至二葉一心期,混合剪取幼苗。于田間采集上述16份糯玉米品種葉片,樣品置于-20°C冰箱保存備用。采用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的DNA提取試劑盒,利用改進后的CTAB法,提取DNA[5]。利用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計（Thermo,USA）檢測DNA質量。

1.3 SSR引物合成

40對引物序列信息見行業標準《NY∕T 1432—2014玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》,引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 PCR擴增

10 μL 反應體系包含100 ng 基因組 DNA、左右引物各2 μmol∕L、2.5 mmol∕L dNTRs、2.5 mmol∕L MgCl2、1 ×RCR buffer（10 mmol∕L Tris-HCl,pH 8.5,50 mmol∕L KCl）和 0.5 U Taq 酶。 RCR 反應的程序為:94 ℃預變性3 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,36個循環;72℃延伸5 min,4℃保存。RCR產物加入2 μL 6×loading buffer,混勻后,變性,程序為:95℃變性5 min,4℃冷卻10 min以上。

RCR產物變性后在4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。90 V預電泳20 min,80 V電泳至上部指示條帶到達膠板中部。用質量分數0.1%的AgNO3溶液銀染12 min;顯影液（2%NaOH,1%甲醛）顯影直至譜帶清晰,拍照。

1.5 結果判定與數據統計

參照《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》（NY∕T 1432—2014）進行判定,若20個SSR基本核心位點中,差異位點數≥2,判定為不同品種;差異位點數≤1,繼續用20對擴展核心引物進行檢測。若累計40個SSR位點中,差異位點數≥2,判定為不同品種;差異位點數=1,判定為近似品種;差異位點數=0,判定為相同品種。

SSR擴增帶型以0、1、9統計,在相同遷移率位置上,無帶記為“0”,有帶記為“1”,缺失記為“9”,建立0、1、9 數字指紋數據庫。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

‘滬玉糯3號’、申W48、申W22和2個待測樣品的OD260∕OD280比值均接近1.8,質量濃度在790—990 ng∕μL,表明本研究提取的樣品DNA質量較好,可用于RCR鑒定（表1）。

表1 DNA質量和質量濃度檢測Table 1 DNA quantification and quality determinations

2.2 ‘滬玉糯3號’品種真實性鑒定

首先,利用20對SSR基本核心引物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對‘滬玉糯3號’標準品和2個待測樣品進行鑒定,發現待測品種1和‘滬玉糯3號’間有6個SSR位點存在差異,差異位點數＞2,說明待測品種1和‘滬玉糯3號’不是同一品種;待測品種2和‘滬玉糯3號’間無SSR差異位點（表2）。為了進一步確定待測品種2的真實性,利用20對SSR擴展核心引物對待測品種2和‘滬玉糯3號’進行RCR鑒定,在待測品種2和‘滬玉糯3號’間也未發現SSR差異位點,推測待測品種2和‘滬玉糯3號’為同一品種（表 2）。

表2 2個待測品種與‘滬玉糯3號’的真實性檢測Table 2 Authenticity Assessment of the two test varieties

2.3 ‘滬玉糯3號’純度鑒定特異引物篩選

利用40對均勻分布于玉米10條染色體上的SSR核心引物,在‘滬玉糯3號’及其親本申W48和申W22間進行擴增,發現18對SSR標記能在申W48和申W22間擴增出多態性條帶,其中,顯性標記6對,共顯性標記12對。為進一步確定可用于‘滬玉糯3號’純度鑒定的SSR標記,對以上12對共顯性標記再次進行了 RCR 擴增,發現 SSR 引物 bnlg1940k7、bnlg2305k4、umc1536k9、bnlg249k2、bnlg2235y5、phi233376y1可在申W48和申W22之間擴增出清晰、穩定的多態條帶,且它們在‘滬玉糯3號’中均能擴增出雙親雜合帶型（圖1）,推測這6對SSR核心引物可用于對‘滬玉糯3號’的純度鑒定。

圖1 在‘滬玉糯3號’親本間存在差異的SSR位點Fig.1 SSR markers could amplify polymorphisms between parents of‘Huyunuo No.3’

2.4 ‘滬玉糯3號’品系特異性鑒定

在40對玉米SSR核心引物中,引物對bnlg1940k7和bnlg2305k4既可在‘滬玉糯3號’和待測品種1間擴增出穩定的多態性條帶,還能在‘滬玉糯3號’的親本申W48和申W22間擴增出雙親互補帶型。因此,利用SSR標記bnlg1940k7和bnlg2305k4在‘滬紫黑糯1號’‘申糯2號’‘佳糯668’‘斯達糯41’等16個糯玉米品種的基因組DNA中進行RCR擴增,以獲得可用于‘滬玉糯3號’品系特異性分析的SSR分子標記。引物對bnlg1940k7和bnlg2305k4均可在‘滬玉糯3號’中擴增出與其他16個糯玉米品種不同的差異帶型,進一步說明SSR標記bnlg1940k7和bnlg2305k4可用于‘滬玉糯3號’品種的真實性鑒定（圖2）。

圖2 ‘滬玉糯3號’品系特異性鑒定Fig.2 Event-specific identification of‘Huyunuo No.3’

2.5 ‘滬玉糯3號’及其親本數字指紋圖譜構建

為了使DNA指紋更加直觀,利用計算機對‘滬玉糯3號’進行品種真實性和親緣關系鑒定,根據常用數據轉換模式,將33對擴增條帶清晰的玉米SSR核心引物在‘滬玉糯3號’及其親本中擴增的DNA指紋轉換成由0和1組成的計算機可識讀的語言（表3）,以便于今后數據庫的錄入和與其他品種、自交系的DNA指紋圖譜比對。

表3 ‘滬玉糯3號’及其親本的數字指紋數據庫Table 3 Numeric fingerprint database of‘Huyunuo No.3’ and its parental inbred lines

3 討論與結論

隨著分子標記技術的快速發展,SSR分子標記已被廣泛應用于玉米品種的真實性和純度鑒定。在篩選適用于玉米雜交種真實性和純度鑒定的引物時,雖然基本要求相同,但是在選擇側重點上仍有所不同:真實性鑒定側重于引物多態率,要求引物多態率高,且多個引物間不連鎖或連鎖不緊密,而對雜合率指標沒有特殊要求;純度鑒定則側重于引物雜合率,在雜交種中能擴增出雙親互補帶型,其次才是多態性指標。

張振良等[6]利用部頒標準NY∕T 1432—2014中公布的20對SSR核心引物,對5個糯玉米疑似雜交種的真實性進行鑒定,鑒定結果與田間鑒定結果一致,說明利用這些SSR標記可以對玉米品種的真實性進行準確鑒定。本研究利用NY∕T 1432—2014標準中公布的40對SSR核心引物對2個糯玉米疑似品種進行了真實性鑒定。 SSR 引物對 umc2007y4、bnlg1940k7、bnlg2305k4、bnlg1702k1、umc1125y3、phi080k15 能在待測品種1和‘滬玉糯3號’間擴增出帶型清晰、穩定性好的多態條帶,說明這6個SSR位點在‘滬玉糯3號’中的多態性和特異性較好;此外,SSR標記 umc2007y4、bnlg1940k7、bnlg2305k4、bnlg1702k1、umc1125y3和phi080k15分別分布于玉米2號、2號、5號、6號、7號和8號染色體,連鎖不緊密,今后在‘滬玉糯3號’品種真實性鑒定中可優先使用以上6對SSR核心引物,可減少工作量、降低試驗成本。

Yashitola等[7]認為對于特定品種,僅需1對特異引物就可以鑒定品種純度。然而,譚君等[8]認為僅用1對引物檢測種子純度是不準確的,一般需要利用3—5對引物才能準確鑒定種子純度。本研究從大量的玉米SSR引物中挑選出40對多態性較高的引物[9],從中篩選出6對能在‘滬玉糯3號’中擴增出清晰、穩定的雙親互補帶型的引物對 bnlg1940k7、bnlg2305k4、umc1536k9、bnlg249k2、bnlg2235y5 和phi233376y1。通過這6對引物的組合使用,可以滿足對‘滬玉糯3號’種子純度鑒定的需要。

在‘滬玉糯3號’品種真實性和純度鑒定工作中,利用本研究篩選的SSR核心引物,結合構建的DNA指紋圖譜,可在較短時間內對‘滬玉糯3號’品種進行大規模的真實性和純度鑒定,這不僅滿足了對種子真實性和純度鑒定簡便、快速、準確、高效的要求,同時也節省了大量的人工和試劑,降低了檢測成本。