轉基因抗蟲水稻秀水134-Bt毒蛋白的時空表達分析

白建江,張建明?,樸鐘澤,方 軍,楊瑞芳,2??,李鋼燮

（1上海市農業科學院作物育種栽培研究所,上海201403,2上海農科種子種苗有限公司,上海201106;3韓國農村振興廳農業技術學院,水原市441-857）

糧食安全和生態安全是我國農業持續發展中的首要問題。水稻蟲害控制主要是通過噴灑化學農藥,農藥的使用,不僅增加成本,造成環境污染,而且收效也越來越小[1]。培育轉基因抗蟲水稻新品種是解決水稻蟲害的有效途徑[2-3]。我國轉基因生物新品種培育科技重大專項于2008年經國務院常務會議審議并通過,實施轉基因生物新品種培育科技重大專項,對于增強農業科技自主創新能力,提升我國生物育種水平,促進農業增效和農民增收,提高我國農業國際競爭力,都具有重要的戰略意義[4]。林冬枝等[5]通過雜交方法把通過安全評估的‘華恢1號’中的Bt基因Cry1Ab∕Cry1Ac轉育到‘秀水134’中,獲得‘Bt秀水134’。秀水134-Bt是上海市農業科學院作物育種栽培研究所以粳稻‘秀水134’為受體材料,通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法導入抗蟲基因cry1Ac1獲得的穩定轉基因純系[6]。本實驗室獲得的秀水134-Bt田間對螟蟲具有高度抗性,且主要農藝性狀沒有因為抗性基因的導入而發生明顯改變[6],為水稻轉基因抗蟲育種提供了一個新材料。目前,轉基因生物技術檢測方法主要包括RCR、Southern Blotting、生物測定法、酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、Western Blotting、膠體金免疫法等[7]。其中ELISA是最常用的一種固相酶免疫測定方法,其基本原理就是抗原抗體的特異性結合和酶對底物的高效催化。該方法特異性強、靈敏度高、結果易于觀察,自出現以來就在臨床檢測中得到廣泛應用,可用來對蛋白進行定量檢測,現在已經用于生命科學的許多領域[8-10]。

本研究利用ELISA方法對轉基因抗蟲水稻秀水134-Bt不同發育時期及不同組織中Bt毒蛋白含量進行檢測,研究轉基因抗蟲水稻秀水134-Bt的毒蛋白時空表達變化規律,以期為轉Bt抗蟲基因秀水134-Bt的安全監管提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

粳稻品種‘秀水134’（用作非轉抗蟲基因水稻對照）,以及用它作為受體材料育成的抗蟲轉基因純合品系秀水134-Bt[6]。

1.2 取樣

分別于水稻的苗期、分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期和成熟期取樣。其中苗期取樣部位為根、莖、葉;分蘗期和拔節期取樣部位為根、莖、葉和葉鞘;孕穗期和抽穗期的取樣部位為根、莖、葉、葉鞘和小穗;成熟期的取樣部位為根、莖、葉、葉鞘和成熟種子。各時期每種材料分別取3個單株,取樣量0.5 g,液氮速凍,-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3 Bt毒蛋白的提取

取20 mg 樣品于離心管中,加入 500 μL 蛋白抽提液（包含 100 mmol∕L Tricine、8 mmol∕L MgCl2、2 mmol∕L EDTA、50 mmol∕L β-Mer-thnol、12.5%Glycerol和 1%RVR-40,pH 7.5）,充分混勻、離心,取上清液。

1.4 ELISA測定Bt毒蛋白濃度

按ELISA試劑盒說明進行試驗操作（Cry1Ab∕Cry1Ac蛋白檢測試劑盒,產品型號:AR003CRBS）。每個樣本3個重復,加樣和測定嚴格按照說明書步驟在規定時間內完成,Bio-radimark酶標儀在450 nm波長下進行讀數。

1.5 標準曲線制作

Bt毒蛋白Cry1Ab∕Cry1Ac標準樣品質量濃度為1 mg∕L（EnviroLogix,Rart 0433）,標準樣品梯度稀釋,分別配制成 1 mg∕L、0.5 mg∕L、0.25 mg∕L、0.125 mg∕L、0 mg∕L 的標準蛋白溶液。 以 OD 值為橫坐標,質量濃度為縱坐標,繪制標準曲線。

1.6 樣本ELISA測定數據處理

根據標準曲線計算出回歸方程,將樣本OD值代入回歸方程,計算出相應的Bt毒蛋白含量,最后將結果換算成每克鮮重含有的Bt毒蛋白納克量,用ng∕g·FW表示。

2 結果與分析

2.1 秀水134-Bt抗蟲性表現

稻縱卷葉螟是危害水稻生長的一種重要害蟲,危害性大、爆發性廣。初孵化幼蟲在水稻葉片取食葉肉,隨后在葉尖處吐絲卷葉,逐漸形成白色條斑。隨著蟲齡增加,葉片危害會越來越嚴重,受害嚴重的稻田一片枯白,水稻嚴重減產。人工接蟲試驗表明,與對照‘秀水134’相比,秀水134-Bt對稻縱卷葉螟表現出高度抗性,轉基因植株的每個單株及每個單株葉片都沒有表現出蟲害,而對照植株幾乎全部出現蟲害（圖1）。

2.2 Bt毒蛋白的時空表達分析

為了解Bt基因在轉基因抗蟲水稻秀水134-Bt中的表達情況,分別測定了不同生長發育時期（苗期、分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期和成熟期）和不同組織器官中Bt毒蛋白的表達情況（表1）。可以看出,各個時期不同器官中Bt毒蛋白均有表達,但表達量差異顯著。同一時期不同組織中Bt毒蛋白表達量存在顯著性差異,苗期葉片中Bt毒蛋白含量達到 4300.97 ng∕g·FW,為根系（10.49 ng∕g·FW）的 400倍以上,為莖（83.34 ng∕g·FW）的50倍左右。 分蘗期和拔節期Bt毒蛋白含量為葉片＞葉鞘＞莖稈＞根,孕穗期Bt毒蛋白含量為葉片＞葉鞘＞莖稈＞小穗＞根,抽穗期Bt毒蛋白在各個器官中表達量高低順序變化不大,小穗含量稍有提高。到蠟熟期,成熟種子中幾乎檢測不到Bt毒蛋白含量,僅為1.95 ng∕g·FW。

秀水134-Bt的Bt基因由Rbcs3啟動子驅動cry1Ac1（GenBank accession no.AY126450）的表達[5],Rbcs3啟動子受光調控,具有綠色組織特異性,已經在水稻、番茄、棉花等植物上證明。本研究顯示,不同生育期Bt毒蛋白在葉片中含量始終最高,測定結果與預期一致。從表1還可以看出,葉片中Bt毒蛋白含量整體表現為隨著植株的生長而減少,在苗期葉片中Bt毒蛋白含量最高,為4300.97 ng∕g·FW,到蠟熟期表達量最低,下降到960.32 ng∕g·FW。這可能與Rbcs3啟動子受光調控有關,到后期隨著光照強度逐漸減弱,表達量也逐漸下降。

圖1 秀水134-Bt及對照‘秀水134’對稻縱卷葉螟的抗性表現Fig.1 Resistance of Xiushui 134-Bt and‘Xishui 134’ to rice leaf roller

表1 秀水134-Bt毒蛋白的時空表達Table 1 The temporal and spatial expression of Bt toxin protein in Xiushui 134-Bt ng·g-1FW

3 討論與結論

秀水134-Bt中Bt基因應用了綠色組織特異性啟動子RBcs3來誘導,目前該啟動子已經廣泛應用到水稻、番茄、棉花、擬南芥、煙草等轉基因植物中,該組織特異性啟動子誘導表達基因只在莖葉等綠色組織中表達,使得蛋白產物富集于莖葉中,減少了在種子中的表達,可以提高消費者心理接受度,進一步提高了轉基因水稻的產品安全問題。前期,本實驗室已經對秀水134-Bt轉基因水稻的主要營養成分、品質性狀等進行了分析,發現其營養成分、品質性狀、理化特性以及支鏈淀粉鏈長分布等均未發生明顯改變[11-12]。

本研究進一步對秀水134-Bt不同時期不同器官中Bt毒蛋白的時空表達情況進行分析,結果顯示葉片中Bt毒蛋白的表達量最高,葉片是螟蟲危害的主要部位,Bt毒蛋白在葉片中表達量高更有利于殺死螟蟲,達到較好的抗蟲效果。同時Bt毒蛋白在水稻籽粒中表達量大大降低或者不表達,進一步證實了組織特異性啟動子Rbcs3的作用,研究結果與Ye等[13]一致,為秀水134-Bt將來的商業化推廣提供了依據。不同發育時期Bt毒蛋白表現為隨著植株生長而減少,Bt毒蛋白以苗期和分蘗期的表達量最高,孕穗期和抽穗期明顯下降,但仍然保持在較高的表達水平,到蠟熟期Bt毒蛋白表達量下降更加明顯。因此,在水稻營養生長階段的苗期或者拔節期對轉基因進行檢測分析可以提高檢測準確性。本研究結果也為轉基因抗蟲水稻適宜檢測時間選擇提供了一定的參考。