香菇L808單雙核菌絲Cx活性和IGS1序列比對分析

宋曉霞,王 倩,趙 妍,黃建春,宋春艷,陳明杰,譚 琦

（上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所,農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術(shù)研究中心,國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)中心,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,上海201403）

香菇的營養(yǎng)階段主要是由兩個異源的單核菌絲經(jīng)質(zhì)配后形成的雙核菌絲,生殖階段是在菌褶表面的擔子中雙核經(jīng)核配、減數(shù)分裂形成的擔孢子。其他子實體部位都是雙核菌絲經(jīng)組織分化形成,未經(jīng)過核配[1]。與雙核菌絲相比,兩個異源單核菌絲的生長速度較慢[2],且沒有單獨形成子實體的能力。可見,香菇的生長發(fā)育過程主要是由受個異源的細胞核基因組協(xié)同控制。一般可用交配型對兩個異核進行區(qū)分,一個是AxBx,一個是AyBy。其中,AxBx單核菌絲具有較高的再生率和較快的生長速度[3-4]。

香菇是一種腐生真菌,在營養(yǎng)和生殖階段均會向胞外分泌大量的纖維素酶。研究表明:香菇雙核菌絲的胞外纖維素酶活性在營養(yǎng)階段先上升后下降,在原基階段又上升,在子實體階段又下降[5]。內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶（Cx,EC 3.2.1.4）是纖維素酶系的組分之一[6],又稱為羧甲基纖維素酶[7],普遍存在于生物體內(nèi),主要通過隨機水解糖苷鍵,將非晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚體。羧甲基纖維素酶活性與香菇的平均鮮重呈顯著負相關(guān),可作為預測香菇平均鮮重的一個間接性指標[8]。

基因內(nèi)間隔區(qū)（Intergenic spacers,IGS）位于核糖體大亞基和小亞基之間,常用于食用菌菌株鑒定和多樣性分析[9-10]。因IGS含有5S rRNA編碼基因,故又分為IGS1和IGS2兩個區(qū)域[11],其中IGS1序列較短,較為保守。Saito等[12]研究16個香菇菌株的IGS1序列發(fā)現(xiàn):不同菌株由于亞重復區(qū)的數(shù)量不同,IGS1呈現(xiàn)多態(tài)性,同一菌株的不同克隆子也表現(xiàn)出多樣的IGS1序列。

鑒于香菇雙核菌絲的生長發(fā)育受兩個異源細胞核基因組的協(xié)同控制,本研究對香菇L808菌種的雙核菌絲和兩個原生質(zhì)體單核菌絲營養(yǎng)生長階段的Cx活性和IGS1的序列進行分析,以期進一步了解兩個單核菌絲所對應(yīng)的細胞核在雙核菌絲分泌Cx和IGS1序列多態(tài)性中可能存在的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

香菇菌種L808由上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（RDA）（美國BD公司）。

液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,牛肉膏5.6 g,磷酸二氫鉀5 g,硫酸鎂1 g,蒸餾水1000 mL,pH自然。

1.3 試劑與儀器設(shè)備

BCA蛋白含量測定試劑盒,內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶（Cx）活性測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）;Rhire Rlant Direct RCR Kit裂解液（Thermo Fisher Scientific）;RCR Magic Mix 3.0（北京天恩澤基因科技有限公司）;SanRrep Column DNA Gel Extraction Kit,pUCm-T Vector Cloning Kit,Ultra-Competent Cell Rreps Kit[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

直徑90 mm無菌塑料平板（Greiner Bio-One GmbH）;SX-500高壓滅菌鍋（Tomy Digital Biology）;VS-1300L-U潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;BSR-250培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;ZHWY-2112B恒溫搖床（Noki）;混勻儀小精靈（Eppendorf）;Allegra X-30R 離心機（Beckman Coulter）。

1.4 菌種活化及單核菌絲制備

菌種活化:將冷藏的L808菌種轉(zhuǎn)接到RDA培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)7 d,再轉(zhuǎn)至新的RDA培養(yǎng)基上,重復2次以上,備用。

單核菌絲制備:參照王麗寧等[13]制備原生質(zhì)體單核菌絲的方法獲得L808的兩個原生質(zhì)體單核菌絲L808R65和 L808R78。

1.5 菌絲生長速度測定

在潔凈工作臺上,用打孔器（直徑10 mm）分別在長L808、L808R65和L808R78菌絲的RDA培養(yǎng)基上打孔,用接種針各挑3塊放入直徑為90 mm含有RDA培養(yǎng)基的平板中。每個菌絲設(shè)3個重復。25℃ 暗光培養(yǎng),每4 d測量1次生長速度。由于3個菌絲的生長速度不一致,在L808菌絲已長滿平板時,L808R78菌絲前端尚未長到新RDA培養(yǎng)基上,因此L808R78菌絲的在RDA培養(yǎng)基上的形態(tài)照片并不與L808和L808R65在同一天拍攝。3個菌絲的生長速度用SRSS 17.0整理與分析。

1.6 Cx活性測定

液體培養(yǎng)和粗酶液制備:在潔凈工作臺上,用打孔器（直徑10 mm）分別在長L808、L808R65和L808R78菌絲的固體培養(yǎng)基上打孔,用接種針各挑3塊具菌絲的培養(yǎng)基放入含150 mL滅菌液體培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中。每個菌絲設(shè)3個重復。25℃靜置24 h,然后在轉(zhuǎn)速為100 r∕min、溫度為25℃的恒溫搖床上培養(yǎng)11 d。從靜置培養(yǎng)開始,每隔3 d在潔凈工作臺上分別吸取每瓶發(fā)酵液1 mL于2.0 mL離心管中,在4℃下4000 r∕min離心15 min,所得上清液即為粗酶液。整個流程直至培養(yǎng)結(jié)束并拍照。

粗酶液蛋白質(zhì)含量（mg∕mL,表示每毫升粗酶液中的蛋白質(zhì)含量）測定采用BCA（Bicinchonininc acid）蛋白濃度檢測法,內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶比活[μg∕（min·mL） prot,將每毫升組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量定義為一個酶活力單位]采用3,5-二硝基水楊酸法測定,具體方法參照各試劑盒說明書。

數(shù)據(jù)分析與整理:采用Excel軟件整理分析數(shù)據(jù)并做圖,采用SRSS 17.0進行顯著性分析。

1.7 IGS1序列測定及分析

菌絲裂解液:挑少量菌絲于含50 μL裂解液的離心管（0.2 mL）中,并在混勻儀上1650 r∕min混勻1 min。

RCR 反應(yīng)體系:菌絲裂解液 1 μL,RCR Magic Mix 12.5 μL,無菌 ddH2O 10.5 μL,正反向引物各0.5 μL。正向引物為 IGS-1-R-1:5’-TTGCGACGACTTGAATGG-3’;反向引物為 Le5SrDNA:5’-TAGGATTCCCGCGTGGTCCCCCA-3’。

RCR反應(yīng)條件及產(chǎn)物檢測:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸3 min,25個循環(huán);72℃終延伸5 min。擴增結(jié)束后,取4 μL反應(yīng)產(chǎn)物在1.2%（w∕v）瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

RCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序:將特異性條帶切膠回收（SanRrep Column DNA Gel Extraction Kit）連接至 pUCm-T 載體（pUCm-T Vector Cloning Kit）,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞（Ultra-Competent Cell Rreps Kit）,經(jīng)藍白斑篩選每個菌絲各挑取9個陽性克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

IGS1序列注釋與分析:用DNASTAR Lasergene 7.1.0軟件中的SeqMan合并同一菌絲IGS1序列完全一致的克隆子,并剔除兩端的引物序列。參照NCBI中已有香菇IGS1序列的注釋信息對獲得的序列進行注釋,分別找到28S rRNA、IGS1和5S rRNA區(qū)域。用MEGA 7.0比對序列,并用DNAMAN 5.2.2將比對結(jié)果輸出成TIFF格式。用DNASTAR Lasergene 7.1.0軟件中EditSeq統(tǒng)計序列的堿基組成、長度和GC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 L808單雙核菌絲形態(tài)特征

L808雙核菌絲在RDA培養(yǎng)基上平均生長速度為（3.08±0.08）mm∕d,邊緣整齊。生長前端菌絲稀疏,分枝少,后端菌絲濃密,分枝多。在液體培養(yǎng)基中的菌球較大（圖1a）;L808R65單核菌絲平均生長速度為（1.15±0.06）mm∕d,邊緣整齊,菌絲較L808雙核菌絲濃密,分枝多。在液體培養(yǎng)基中的菌球大小居中（圖1b）;L808R78單核菌絲平均生長速度為（0.65±0.04）mm∕d,邊緣不整齊,菌絲濃密成雪白色,在RDA平板和液體培養(yǎng)基中都有色素產(chǎn)生。在液體培養(yǎng)基中的菌球最小（圖1c）。

2.2 L808單雙核菌絲Cx活性比對

隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加各菌絲胞外蛋白質(zhì)含量變化幅度和趨勢不同（圖2a）:L808含量變化的幅度最大,從3 d時的28.85 mg∕mL逐步下降到12 d時的15.88 mg∕mL;L808R65含量變化的幅度次之,從3 d時的14.36 mg∕mL 升高到9 d時的20.70 mg∕mL,又在12 d時下降到15.53 mg∕mL;L808R78含量變化幅度最小,主要維持在15.00 mg∕mL左右,僅6 d時的含量低于了15.00 mg∕mL。

隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加各菌絲Cx比活變化幅度和趨勢也不同（圖2b）:L808R78活性變化的幅度最大,從3 d 時的 1.34 μg∕（min·mL） prot上升到 9 d 時的 4.00 μg∕（min·mL） prot,在 12 d 時又下降到2.79 μg∕（min·mL） prot;L808 活性變化幅度次之,從 3 d 時的 0.76 μg∕（min·mL） prot上升到 6 d 時的1.80 μg∕（min·mL） prot,隨后又逐步下降至 12 d 時的 1.31 μg∕（min·mL） prot;L808R65 活性變化幅度最小,從3 d 時的2.01 μg∕（min·mL） prot逐步下降到9 d 時的 1.06 μg∕（min·mL） prot又上升至12 d 時的1.91 μg∕（min·mL） prot。

圖1 固體和液體培養(yǎng)L808單雙核菌絲形態(tài)差異Fig.1 Morphological difference among monokaryotic and dikayotic mycelia of L808 on PDA medium and in the liquid medium

圖2 L808單雙核菌絲不同培養(yǎng)時間蛋白質(zhì)含量（a）和Cx比活（b）Fig.2 Protein content（a）and specific enzyme activity of Cx（b）among monokaryotic and dikayotic mycelia of L808 at the different cultivation time

2.3 L808單雙核菌絲IGS1序列差異分析

通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖3a）,L808、L808R65和L808R78的 RCR片段長度一致,在1100 bp左右。通過測序,9個L808克隆子明顯含有2個不同的IGS1序列:4個克隆的序列一樣,命名為L808-c1（GenBank號為 MF177505）;5個克隆的序列一樣,命名為 L808-c2（GenBank號為 MF177506）。L808R659個克隆的IGS1序列與L808-c1完全一致。L808R78除1個克隆的1個堿基有突變外（A變?yōu)镚）,其他8個克隆的序列與L808-c2完全一致。

L808-c1和L808-c2序列的相似度為96.67%:前者IGS1全長1003 nt（A:278;G:188;T:360;C:177）,GC含量為36.39%;后者IGS1全長1041 nt（A:294;G:196;T:371;C:180）,GC含量為36.12%。與L808-c2相比,L808-c1僅有兩個堿基有替換,主要為堿基缺失（圖3b）。

圖3 L808單雙核菌絲IGS1電泳圖譜（a）及L808兩個IGS1序列比對（b）Fig.3 IGS1 electrophoresis pattern among monokaryotic and dikayotic mycelia of L808,and alignment between two IGS1 sequences of L808

3 討論

香菇是一種腐生真菌,在其營養(yǎng)和生殖階段均會不斷向外界分泌胞外酶以分解外界的有機物,從而獲取有機營養(yǎng)物。胞外蛋白質(zhì)是各種胞外水解酶的總合[14],蛋白質(zhì)含量的不同表明了香菇生長過程中對外界營養(yǎng)物的分解和利用能力。L808在3 d時的蛋白質(zhì)含量就達到了28.85 mg∕mL,遠遠高于兩個單核菌絲各培養(yǎng)階段的含量,說明L808在3 d內(nèi)對外界營養(yǎng)的分解和利用能力就很高。L808R65在9 d時才升高到了20.70 mg∕mL,對外界營養(yǎng)的分解和利用能力居中。而L808R78一直維持在15.00 mg∕mL左右,在第6天還略有下降,對外界營養(yǎng)的分解和利用能力最低。這一變化規(guī)律與它們的生長速度有關(guān),無論是在RDA平板還是液體培養(yǎng)基中,L808的生長速度最快,其次是L808R65,L808R78最慢。由于L808雙核菌絲的酶活力是由兩個異源細胞核協(xié)同控制,因此在L808雙核菌絲生長階段分泌胞外酶時可能是L808R65對應(yīng)的細胞核在起著主效作用。

Cx僅是纖維素酶中的一種,它的活性大小能反映生物分解纖維素的能力。倪新江等[15]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)料成分的不同只能影響胞外酶活性的相對大小,而不影響酶活性變化規(guī)律。與楊舒貽等[16]同樣研究L808雙核菌絲的纖維素酶活力變化結(jié)果相比,本研究Cx比活變化趨勢也是先升高后降低,但出現(xiàn)最高峰的結(jié)果不是在第13天而是第6天。估計這與選擇張權(quán)[17]篩選出的最適L808香菇菌絲生長的液體培養(yǎng)基來培育L808單雙核菌絲有關(guān),其做出的酶活最高峰也是在第6天。與L808相比,L808R78出現(xiàn)最高峰的時間要晚,在第9天,但含量卻很高,達到了4.00 μg∕（min·mL）prot,遠遠高于L808和L808R65各個培養(yǎng)時間的活性,說明L808R78分解纖維素的能力最強。由于L808雙核菌絲的酶活力是由兩個異源細胞核協(xié)同控制,因此在L808雙核菌絲生長階段分泌Cx可能是L808R78對應(yīng)的細胞核在起著主效作用。

本研究中L808雙核菌絲共有兩個IGS1序列:L808-c1和L808-c2,其中L808R659個克隆子的序列與L808-c1完全一致,L808R788個克隆子的序列與L808-c2完全一致。另一個克隆子的序列僅有1個堿基與L808-c2不同。由于DNA測序很容易產(chǎn)生點突變[18],所以對于獲得的擁有1個點突變堿基的L808R78克隆序列是真的突變還是試驗誤差造成的假陽性,目前很難判斷,需要進一步驗證。但考慮到兩個單核菌絲IGS1位于核糖體DNA（Ribosomal DNA,rDNA）上,而rDNA主要分布在細胞核中的染色體上[19],L808雙核菌絲的IGS1序列應(yīng)該是兩個異源細胞核IGS1序列的組合。另外,由于IGS1序列并不直接參與Cx的表達過程,所以單核菌絲的IGS1序列是否與其Cx活性之間存在相關(guān)性還需進一步研究,但將IGS1序列作為鑒定和區(qū)分L808兩個單核菌絲的分子標記還是可行的。