鴨IFN-β啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及活性檢測

高全新,劉云霞,程玉強(qiáng),嚴(yán)亞賢,孫建和?

（1上海市寶山區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海201900;2上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200240）

鴨是主要的家禽養(yǎng)殖物種,近年來高致病性禽流感的流行,給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也對公共安全產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。干擾素（Interferon,IFN）具有抗病毒、抗腫瘤活性,且有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用[1],對于禽類的天然免疫及觸發(fā)獲得性免疫十分重要[2]。根據(jù)IFN氨基酸序列及其特異性識(shí)別受體的不同,可將IFN分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,其中β干擾素（IFN-β）屬于Ⅰ型IFN。IFN-β是由微生物、dsRNA和病毒等干擾素誘生劑刺激細(xì)胞后所產(chǎn)生的高活性多功能蛋白,抗病毒活性較強(qiáng),具有廣譜的抑制病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力和激素刺激等生物學(xué)活性,在細(xì)胞因子基礎(chǔ)和臨床研究中具有重要價(jià)值[3]。

由于IFN-β具有很強(qiáng)的疏水性,目前一直沒有可靠穩(wěn)定的色譜方法對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。目前IFN活性檢測方法主要有:抗病毒活性檢測方法,常利用水泡性口炎病毒（VSV）進(jìn)行檢測,但該方法敏感性和準(zhǔn)確率較低,且具有一定的生物安全危險(xiǎn)性[4];ELISA檢測方法[5],檢測方便快捷,但局限于檢測IFN的抗原性,且不同IFN需要不同的單抗,通用性低;熒光定量RCR檢測方法[6],該方法在提取宿主細(xì)胞mRNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行,但由于RNA極不穩(wěn)定,對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定影響。因此,建立一種適用范圍廣、精確率高的檢測方法對IFN的研究具有重要意義。

啟動(dòng)子是真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游一段長度不等的特異性序列,該片段有多種調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn),能順式調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,因此可以通過檢測啟動(dòng)子的激活程度間接定量蛋白（如Ⅰ型干擾素）的表達(dá)量。熒光素雙報(bào)告基因系統(tǒng)具有檢測快速、靈敏度高、線性范圍廣,且在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無內(nèi)源性表達(dá)等諸多優(yōu)點(diǎn)[7]。本試驗(yàn)擬將鴨IFN-β的啟動(dòng)子片段插入帶有熒光素酶基因的報(bào)告質(zhì)粒上,若啟動(dòng)子被激活,則其下游的熒光素酶表達(dá),通過對熒光素酶的檢測可間接測定IFN-β的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)鴨胚購自上海凌華綠頭鴨養(yǎng)殖合作社;dsDNA質(zhì)粒pCAGGS、pGU-GFR、RIG-I真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-RIG-I由上海交通大學(xué)上海獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存;Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體（pGL3.0）、海腎熒光素酶報(bào)告基因載體（pRLTK）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒均購自Rromega公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、組織DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;一步連接酶、限制性內(nèi)切酶Nhe I、BglⅡ購自大連寶生物工程（TaKaRa）公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;poly（I:C）購自Invivogen公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶均為GIBCO公司產(chǎn)品;引物合成及測序由北京六合華大基因科技有限公司上海分公司完成。

1.2 鴨IFN-β基因啟動(dòng)子及5個(gè)逐段缺失片段的PCR擴(kuò)增

按照組織DNA提取試劑盒說明書從鴨氣管組織中提取鴨基因組DNA,于-20℃保存。根據(jù)GenBank上已公布的鴨IFN-β基因啟動(dòng)子序列（登錄號:KM032183.1）設(shè)計(jì)6對分別用于擴(kuò)增IFN-β啟動(dòng)子區(qū)域-1530位、-1194位、-792位、-390位、-180位、-90位至第一外顯子+63位6個(gè)片段的引物（表1）。以提取的基因組DNA為模板,進(jìn)行RCR擴(kuò)增。RCR反應(yīng)體系為:RrimeSTAR GXL 1.5 μL、5×buffer 10 μL、dNTR 4 μL、DNA 模板 1 μL、上下游引物各 2 μL、ddH2O 29.5 μL,總體積50 μL;反應(yīng)程序:98℃變性10 s、58℃退火15 s、68℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);68℃終延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖檢測后切膠回收,于-20℃保存待用。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.3 鴨胚成纖維細(xì)胞的制備

參照沈?qū)W懷等[8]方法取11日齡鴨胚處理,取出鴨胚用RBS洗凈,去除殘留血液及胚液,去掉頭頸四肢,剪碎后以胰酶消化,將消化物用5倍體積的高糖DMEM培養(yǎng)基輕輕浸洗2—3次,至懸液清亮,經(jīng)四層紗布過濾后3000 r∕min離心3 min,去上清后保留底部細(xì)胞,以7%胎牛血清（FBS）-高糖DMEM培養(yǎng)基重懸,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4—6 h,然后于顯微鏡下觀察其貼壁情況,貼壁細(xì)胞即為鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）。

1.4 鴨胚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件摸索

按照脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前將生長狀態(tài)良好的DEF細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞密度接種于24孔板,待細(xì)胞單層長至匯合度約為90%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前,培養(yǎng)基換為10%FBS的 DMEM,每孔 400 μL,用 DMEM 分別將 0.5 μL、1 μL、2 μL 和 4 μL 的脂質(zhì)體與 0.5 μg 綠色熒光質(zhì)粒pGU-GFR預(yù)混至100 μL,常溫孵育20 min后均勻滴入每孔。轉(zhuǎn)染6 h后換為10%FBS的DMEM（無雙抗）,轉(zhuǎn)染20 h后于顯微鏡下觀察拍照。

1.5 熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及鑒定

將1.2中回收的片段與pGL3.0分別用Nhe I、BglⅡ進(jìn)行雙酶切處理,按照一步連接酶說明書進(jìn)行連接,構(gòu)建6個(gè)包含鴨IFN-β啟動(dòng)子不同長度片段的重組質(zhì)粒pGL-IFN-β-1593、pGL-IFN-β-1257、pGL-IFN-β-855、pGL-IFN-β-453、pGL-IFN-β-243、pGL-IFN-β-153,轉(zhuǎn)化 Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞,測序正確后按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

1.6 報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞

為檢測DEF細(xì)胞在pCAGGS-RIG-I、雙鏈短RNA類似物poly（I:C）或pCAGGS刺激下IFN-β的激活情況,按照1.4中的方法,將各重組報(bào)告質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑及刺激物（表2）用DMEM稀釋至100 μL,常溫孵育20 min后均勻滴入每孔。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。6 h后換為10%FBS的完全培養(yǎng)基,并將poly（I:C）刺激組用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒收集細(xì)胞,測熒光值。其余組在20 h后測熒光值。

表2 各組轉(zhuǎn)染試劑Table 2 Transfection reagents of each group

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨IFN-β基因啟動(dòng)子的克隆

以鴨氣管組織提取的鴨基因組DNA為模板,用設(shè)計(jì)的6對引物進(jìn)行RCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后表明,獲得的6個(gè)片段大小與預(yù)期一致,分別為1593 bp、1257 bp、855 bp、453 bp、243 bp和153 bp（圖1）。產(chǎn)物回收后與pGL3.0質(zhì)粒連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、測序正確后提取質(zhì)粒。

2.2 鴨胚成纖維細(xì)胞的制備

將制備的鴨胚成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),培養(yǎng)12 h后觀察到細(xì)胞貼壁。如圖2所示,細(xì)胞呈細(xì)長狀,生長良好,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 鴨IFN-β啟動(dòng)子及各亞克隆瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of duck IFN-β promoter and sub-clones by agarose gel electrophoresis

圖2 鴨胚成纖維細(xì)胞顯微鏡觀察（10×10）Fig.2 Microscopic observation of duck embryo fibroblasts（10 ×10）

2.3 鴨胚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件摸索

如圖3所示,在10×10倍放大倍數(shù)的兩列圖中,左側(cè)為藍(lán)色光激發(fā)的綠色熒光視野,綠色發(fā)光斑塊代表熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),右側(cè)是同一視野下普通顯微鏡拍攝圖片;10×20倍放大倍數(shù)更清晰地展示了細(xì)胞形態(tài)。觀察普通顯微鏡下拍攝的圖片可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞隨著轉(zhuǎn)染試劑濃度增高而凋亡增多,在綠色熒光視野下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染試劑為1 μL∕孔時(shí),熒光強(qiáng)度最強(qiáng),且細(xì)胞狀態(tài)較好。因此,確定后續(xù)試驗(yàn)的轉(zhuǎn)染體系為1 μL∕孔。

2.4 熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)錄活性檢測

分別以pCAGGS-RIG-I、poly（I:C）或pCAGGS為刺激物與重組報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞,檢測在不同刺激下IFN-β的激活情況。結(jié)果顯示:在3種不同刺激物作用下,pGL-IFN-β-1593報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶的表達(dá)量均與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組差異極顯著。其中,在pCAGGS-RIG-I的刺激下,pGL-IFN-β-1593報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶的表達(dá)量是空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的280倍,在雙鏈RNA類似物poly（I:C）刺激下的表達(dá)量是空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的380倍,在pCAGGS刺激下的表達(dá)量是空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的14倍。

圖3 不同轉(zhuǎn)染試劑濃度下DEF細(xì)胞的綠色熒光素轉(zhuǎn)染效果Fig.3 Transfection effect of green fluorescein in DEF cells with different transfection reagent concentration

圖4 不同刺激物對雙熒光素酶報(bào)告基因的激活情況Fig.4 Activation of dual luciferase reporter gene with different stimulators

2.5 鴨IFN-β核心啟動(dòng)子區(qū)域確定

為探索鴨IFN-β的核心啟動(dòng)子區(qū)域,將不同截短片段連接入pGL3.0構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞,使用 poly（I:C）或 pCAGGS進(jìn)行刺激。 結(jié)果表明:pGL-IFN-β-1593、pGL-IFN-β-1257、pGL-IFN-β-855、pGL-IFN-β-453、pGL-IFN-β-243 均能被poly（I:C）或pCAGGS 有效激活,pGL-IFN-β-453 表現(xiàn)出最高的熒光素酶活性。截短至啟動(dòng)子區(qū)僅含90 bp（pGL-IFN-β-153）時(shí),報(bào)告基因完全不能被激活。綜合激活強(qiáng)度及插入片段長度等因素,后續(xù)研究將選擇激活強(qiáng)度高、插入片段短的pGL-IFN-β-453重組質(zhì)粒用于鴨IFN-β啟動(dòng)子活性的檢測。

圖5 不同截短片段構(gòu)建的雙熒光素報(bào)告基因活性Fig.5 The activity of dual luciferase reporter gene constructed by different truncated fragments

2.6 鴨IFN-β報(bào)告基因用于RLR信號通路激活檢驗(yàn)

為驗(yàn)證構(gòu)建的鴨IFN-β報(bào)告質(zhì)粒是否可用于檢測先天性免疫信號通路中的激活情況,將不同截短片段連接入pGL3.0構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞,以RLR家族的RIG-I過表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行刺激,結(jié)果表明:在 pCAGGS-RIG-I過表達(dá)的 DEF 細(xì)胞中,pGL-IFN-β-1593、pGL-IFN-β-1257、pGL-IFN-β-855、pGL-IFN-β-453、pGL-IFN-β-243 均能被激活,而空載體和 pGL-IFN-β-153 均不能被 pCAGGS-RIG-I激活。

圖6 不同截短片段在RLR信號通路中激活I(lǐng)FN-β的活性Fig.6 Activation of IFN-β by different truncated fragments in RLR signaling pathway

3 討論

IFN-β作為機(jī)體重要的細(xì)胞因子,在先天免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。許多研究發(fā)現(xiàn),雞源病毒如AIV、NDV等均能抑制IFN-β的產(chǎn)生。Megan等[9]研究發(fā)現(xiàn),在雞中不存在RIG-I基因,而在鴨中存在RIG-I基因,并且發(fā)現(xiàn)鴨RIG-I介導(dǎo)的抗病毒天然反應(yīng)在抵抗流感病毒復(fù)制和清除流感病毒中起著重要的作用。干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferon regulatory factors,IRFs）是一類在IFN信號通路中起重要調(diào)控作用的多功能轉(zhuǎn)錄因子,在IFN的誘導(dǎo)、病毒防御、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長與凋亡和許多疾病的調(diào)節(jié)中具有重要作用。在哺乳動(dòng)物中已證實(shí)具有誘導(dǎo)I型IFN作用的IRF3和參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活以及IFN級聯(lián)反應(yīng)中正反饋調(diào)節(jié)的IRF9在雞中缺失[10-11],對于鴨是否也缺失這兩個(gè)成員目前還未有報(bào)到。以上兩個(gè)機(jī)制在某些程度上解釋了鴨相對于雞對高致病性禽流感等有著更強(qiáng)的抵抗力這一問題,因此研究鴨IFN-β免疫通路對于探討流感等病毒與鴨的相互作用具有重要意義,同時(shí)也可為運(yùn)用轉(zhuǎn)基因方法改善雞對病毒較低的抵抗力奠定理論基礎(chǔ)。鴨IFN-β快速準(zhǔn)確的活性定量檢測是進(jìn)行上述研究的前提。

報(bào)告基因檢測系統(tǒng)具有靈敏度高、操作周期短等特點(diǎn),目前在探討啟動(dòng)子作用、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物誘導(dǎo)作用、病毒與細(xì)胞相互作用等研究中均涉及到報(bào)告基因的應(yīng)用。維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）是RIG-I樣受體家族成員之一,能夠識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的病毒RNA并激活下游的線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）,MAVS與干擾素基因刺激因子（STING）互作,激活NF-κB通路和 IRF3∕7通路,致使促炎癥細(xì)胞因子和I型干擾素（IFN-I）表達(dá)[12-14]。poly（I:C）是雙鏈短RNA類似物,常被認(rèn)為是IFN-β的誘生劑,可模擬雙鏈短RNA病毒感染細(xì)胞時(shí)模式識(shí)別受體（Rattern recognition receptors,RRR）的識(shí)別[15-16],進(jìn)而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-I等細(xì)胞因子;鴨乙型肝炎病毒（DHBV）等DNA病毒常引起家禽感染患病,病毒DNA注入宿主細(xì)胞后,胞內(nèi)Toll樣受體（Toll-like receptors,TLR）如TLR2、TLR3能特異性識(shí)別外源DNA,進(jìn)而激活下游的I型干擾素信號通路[17]。pCAGGS為普通表達(dá)質(zhì)粒,在本研究中作為dsDNA刺激物用于檢測報(bào)告質(zhì)粒在外源DNA刺激下的活性。因此,將poly（I:C）、pCAGGS-RIG-I或pCAGGS與構(gòu)建的重組報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染DEF,能激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子,使得下游的熒光素酶得以表達(dá),同時(shí)IFN-β啟動(dòng)子的激活程度與熒光素酶的表達(dá)量正相關(guān),表明了IFN-β定量檢測的可行性。

將包含鴨IFN-β啟動(dòng)子1530 bp、第一外顯子63 bp的片段鏈接至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,與不同刺激物共轉(zhuǎn)染DEF,熒光素酶的表達(dá)量均較高,且在不同的刺激物下表達(dá)量不同,表明可以利用此雙報(bào)告基因系統(tǒng)定量檢測不同條件下IFN-β的表達(dá)水平。將不同截短長度的鴨IFN-β啟動(dòng)子片段連接至報(bào)告質(zhì)粒,通過檢測熒光素酶的表達(dá)量可推測啟動(dòng)子的關(guān)鍵功能域。本研究中,將啟動(dòng)子截短至-180到+63位仍有大量熒光素酶的表達(dá),說明該區(qū)域包含關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域,這與GenBank上已公布的鴨IFN-β基因啟動(dòng)子序列（登錄號:KM032183.1）注釋結(jié)果相同,其中-102位至-84位為干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）的結(jié)合位點(diǎn),-81位至-71位為NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。截短片段-390到+63位與全長構(gòu)建的重組報(bào)告質(zhì)粒具有相同檢測活性,因此在后續(xù)研究中可運(yùn)用該片段構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒檢測IFN-β的表達(dá)水平,不僅可以達(dá)到較高的準(zhǔn)確率,同時(shí)還可降低整個(gè)檢測質(zhì)粒的堿基數(shù),除去冗余堿基的影響。

綜上所述,本研究克隆了鴨IFN-β啟動(dòng)子,成功構(gòu)建了具有轉(zhuǎn)錄活性的IFN-β熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng),為鴨IFN-β免疫通路的研究奠定了基礎(chǔ)。