生脈飲與四君子湯中用生曬參或紅參對巨噬細胞免疫作用的比較研究

張 凡 趙 遠 曹麗娟 姜恒麗 賈天柱▲

1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧大連 116600；3.上藥康麗(常州)藥業有限公司，江蘇常州 213100；4.盛實百草藥業有限公司，天津 300301

四君子湯首載于《太平惠民和劑局方》，組方為人參、麩白術、茯苓、炙甘草，是益氣健脾，為治療脾胃氣虛證的基礎方劑[1]。生脈飲首載于《醫學起源》，組方為人參，麥冬，五味子，功效為益氣生津，斂陰止汗，多用于心血管疾病的治療[2]。在原方中四君子湯是以生曬參納入方劑用藥的，而生脈飲中則是以紅參納入方劑的。人參作為百草之王，有多種炮制品，常用的炮制品為生曬參和紅參。生曬參經過蒸制而得紅參，在炮制過程中活性成分發生了量變和質變[3]。在臨床應用方面，生曬參多用于補氣生津，治療氣陰不足，津傷口渴等癥，以清補為佳； 紅參則味甘性溫，以溫補為主，常用于治療體虛欲脫，肢冷脈微，氣不攝血等癥[4]。藥效學顯示，四君子湯和生脈飲均有一定的免疫調節的作用[5-6]，但在四君子湯和生脈飲中，這兩種方劑的原方選擇不同的人參炮制品入藥，其原理并沒有相關報道，故在本實驗中先應用CCK-8法測定RAW264.7細胞存活率來篩選給藥濃度，ELISA 法檢測細胞培養液中NO、ROS、TNF-α的含量來評價免疫效果，進而從體外細胞效應角度評價人參生熟飲片對四君子湯和生脈飲對免疫調節的差異，確定四君子湯中最佳的人參炮制品種。故本實驗以不同的側重點，將不同飲片納入相同方劑，將相同飲片納入不同方劑，以期找出差別，說明原理，進而從方劑層面說明人參的生熟差異，為人參在臨床使用中提供科學依據，促進人參的合理用藥提供科學依據[7]。

1 材料與方法

1.1 藥材

人參鮮品購自遼寧省桓仁縣，對照2010版中華人民共和國藥典鑒定為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey）的根。各人參炮制品由遼寧省中藥炮制工程技術研究中心制備。白術（購自安徽濟人藥業有限公司，批號：111018），茯苓塊（購自安徽濟人藥業有限公司，批號：120716），甘草（購自安徽濟人藥業有限公司，批號：120608），麥冬（購自安徽濟人藥業有限公司，批號：120506），五味子購自丹東大梨樹五味子GAP基地。

1.2 試劑

DMEM高糖培養基（Thermo公司）；胎牛血清（Thermo公司）；胰酶、EDTA （Reanta公司） 青霉素、鏈霉素雙抗（Thermo公司）；中性紅粉末（上海哈靈生物醫藥科技有限公司）；HANKS液（上海哈靈生物醫藥科技有限公司）；CCK-8試劑盒 （上海哈靈生物醫藥科技有限公司）； NO、ROS、TNF-αELISA試劑盒（上海哈靈生物藥業有限公司）；DMSO 為ACS級；75%醫用消毒酒精；小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7細胞株（由美國模式培養物集存庫ATCC提供），并凍存于遼寧中醫藥大學炮制實驗室-80℃冰箱中備用。

1.3 儀器

超凈工作臺（上海智城 ZHJH-C1112B），倒置顯微鏡（寧波永新NIB-100），CO2培養箱（日本三洋MCO-15AC），Alpha 4冷凍干燥機（Christ北京思達興業儀器有限公司）Multiskan MK3酶標儀（Thermo公司），細胞培養用具等。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備 生曬參四君子湯的制備：取生曬參、麩白術、茯苓、炙甘草按照3∶3∶3∶2的比例400mg，加10倍量的蒸餾水浸泡0.5 h，煎煮2次后，過濾，合并濾液，濃縮并凍干成粉，再用DMEM溶解凍干粉，配制成含生藥量為100、200、400、800、1600、3200、4000mg/L 的 培 養 液，混 勻，0.22μm 濾膜濾過，置-20℃備用。

紅參四君子湯的制備：將上方中的生曬參換為紅參，用制備生曬參四君子湯的方法制備紅參四君子湯，制備相同濃度的含藥培養基，保存備用。

生曬參生脈飲的制備：取生曬參、麥冬。五味子按照1∶2∶1的比例400mg，加10倍量的蒸餾水浸泡0.5h，煎煮2次后，過濾，合并濾液，濃縮并凍干成粉，再用DMEM溶解凍干粉，配制成含生藥量為 100、200、400、800、1600、3200、4000mg/L 的培養液，混勻，0. 22μm 濾膜濾過，置-20℃備用。

紅參生脈飲的制備：將上方中的生曬參換為紅參，用制備生曬參生脈飲的方法制備紅參生脈飲，制備相同濃度的含藥培養基，保存備用。

1.4.2 RAW264.7細胞培養 細胞按常規培養，DMEM 培養基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗，置于 37℃ ，5% CO2細胞培養箱中培養，0.25% 胰酶消化傳代，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.4.3 CCK-8法篩選RAW264.7細胞不同給藥濃度 以生曬參四君子湯及紅參生脈飲為例，篩選最佳的給藥濃度范圍。調整細胞濃度至3×104/mL 接種至入 96 孔板100μL，并留出1個孔，不加細胞懸液，作為空白對照組，培養24h后，再棄去原培養液，并在 96 孔板中依次加入生曬參四君子湯 4000，3200，1600，800，400，200mg/L 各 10μL，不加藥液的不干預組作對照； 培養24 h，加入10μL CCK-8試劑后再孵育4h，用酶標儀以540nm波長測定吸光度 A。每給藥組設5個副孔，取平均值計算其細胞活力 = （A藥液-A空白）/（ A不干預-A空白）× 100%。

1.4.4 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響[8]將小鼠腹腔巨噬細胞接種于96孔細胞板，貼壁后加入100、200、400和800mg/L濃度的生曬參四君子湯，紅參四君子湯，生曬參生脈飲，紅參生脈飲藥物（以下簡稱生四君，紅四君，紅生脈和生生脈），孵育24h，棄上清，加質量濃度為0.75g/L中性紅200μL/孔，置37℃，5% CO2孵箱培養30min后棄上清，Hanks液200μL/孔，洗3遍，最后每孔加150μL Hanks液，反復凍融，直到細胞破裂，540nm下測定OD值，按下公式計算吞噬增加率／%=（A藥液-A對照）/A對照×100%。每給藥組設 3 個副孔。

1.4.5 對巨噬細胞NO、ROS、TNF-α釋放的影響[9-11]RAW264.7細胞消化后，調整細胞濃度為3×104/mL，向96孔細胞培養板中加入100μL細胞懸液，培養24h待其貼壁后，棄去上清液。處理組各加入200μL的生四君，紅四君，紅生脈和生生脈提取液，對照組加入200μL DMEM完全培養液。37℃、5%CO2培養箱中培養24h后，取上清液，ELISA法測定細胞上清液中NO、ROS、TNF-α的含量。每給藥組設 3 個副孔。

1.5 統計學方法

本實驗結果數據采用SPSS16.0統計軟件，數據資料以（x±s）表示，統計方法用單因素方差分析與組間LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RAW264.7 各組給藥藥液濃度篩選

隨著四君子湯（ 紅參） 藥液濃度的增加，細胞的活力逐漸減弱，表明藥液濃度過高會對巨噬細胞產生毒性作用； 選擇細胞活力最接近不干預組的4 個濃度，確定給藥濃度為100～800mg/L，見表1。

2.2 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅吸光度和增長率的影響

測量結果與計算結果分別見表2 ～ 3。從測量得到的結果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細胞吞噬中性紅的吸光度（P＜0.05），從表中可以看出，隨著濃度的增加，吸光度逐漸增加，當濃度達到400mg/L時，吸光度達到最大，再增加給藥濃度，吸光度出現下降的趨勢；同劑量與生四君組比較，在100mg/L時紅四君有顯著差異為（0.80±0.05），在200mg/L時生生脈有顯著差異，吸光度為（0.75±0.10）；在800mg/L時生生脈有顯著差異，吸光度為（0.60±0.08），其余同劑量組間沒有顯著差異。

表 1 不同濃度生曬參四君子湯對心肌細胞活力影響（x ± s，n=5）

表2 各給藥組對巨噬細胞吞噬中性紅吸光度的影響（x ± s，n=3）

表3 各給藥組對巨噬細胞吞噬中性紅增長率的影響（n=3，%）

2.3 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞NO的影響

計算結果分別見表4。從測量得到的結果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細胞上清液中NO的含量（P＜0.05）；從表中可以看出，隨著濃度的增加，NO的釋放量逐漸增加，當濃度達到400mg/L時，釋放量達到最大，再增加給藥濃度，釋放量出現下降的趨勢，400mg/L時，NO釋放量存在顯著差異（P＜0.05）；同劑量時與生四君組比較，生四君組400mg/L對巨噬細胞NO的影響為（24.31±1.93）μmol/L均高于其同劑量其他三組。

表4 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞NO的影響（μmol/L，x ± s，n=3）

表5 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞ROS的影響（IU/mL，x ± s，n=3）

表6 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α的影響（ng/L，x ± s，n=3）

2.4 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞ROS的影響

計算結果分別見表5。從測量得到的結果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細胞上清液中ROS的含量（P＜0.05）；隨著濃度的增加，ROS 的釋放量逐漸增加，當濃度達到400mg/L時，釋放量達到最大，再增加給藥濃度，釋放量出現下降的趨勢，但是在400mg/L時，ROS釋放量不存在顯著差異（P＞0.05）；同劑量下，在800mg/L時，生生脈組與生四君對巨噬細胞ROS的影響分別為（533.16±73.88）IU/mL、（629.77±64.66）IU/mL 組存在顯著差異，效果上生四君組優于紅四君組，紅生脈組優于生生脈組，但各組之間沒有顯著差異。

2.5 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α的影響

計算結果分別見表6。從測量得到的結果可以看出，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細胞上清液中TNF-α的含量（P＜0.05）；隨著濃度的增加，TNF-α的釋放量逐漸增加，當濃度達到400mg/L時，釋放量達到最大，再增加給藥濃度，釋放量出現下降的趨勢，與400mg/L組比較，100和800mg/L有顯著性差異（P＜0.05）；同劑量組與生四君組比較，生生脈組對TNF-α的影響分別為（18.28±1.53）ng/L、（16.47±1.44）ng/L（P ＜ 0.05）呈顯著性差異，效果上生四君組優于紅四君組，紅生脈組優于生生脈組。

3 討論

3.1 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅吸光度和增長率的影響[12]

本實驗結果表明，各給藥組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力高于空白組， 說明生曬參四君子湯、紅參四君子湯、紅參生脈飲和生曬參生脈飲均有顯著增強巨噬細胞的活性，提高巨噬細胞的吞噬能力；同時比較各組數值，在400mg/L時增強效果最為明顯，細胞活性最強，說明400mg/L為其最佳濃度，促進巨噬細胞的作用最強；比較同方劑生熟之間的差異，四君子湯組中生曬參組方數值上優于紅參組方；同時生脈飲組中，紅參組方在數值上優于生曬參組方，但是生、紅組方間不存在顯著差異。

3.2 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞NO的影響[13]

巨噬細胞可釋放NO因子，而NO的一個最突出的作用是增強巨噬細胞對抗病毒、細菌、真菌、腫瘤細胞等作用。本實驗結果表明，四君子湯與生脈飲能夠促進巨噬細胞釋放NO，隨著給藥濃度的增加，NO的釋放量逐漸增加，當濃度達到400mg/L時，釋放量達到最大，同劑量時與生四君組比較，400mg/L時，紅四君組、生生脈組和紅生脈組均低于生四君組。

3.3 對小鼠腹腔巨噬細胞ROS的影響[14]

需氧細胞在代謝過程中產生一系列活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可雙向調控某些腫瘤細胞的凋亡和增殖，并發現了自由基與細胞信號轉導之間的內在關聯，同時ROS在啟動和維持的再生反應中必不可少。本實驗結果表明，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細胞上清液中ROS的含量；當濃度為400mg/L時，ROS 的釋放量達到最大，說明400mg/L為其最佳給藥濃度；同劑量下，在100和800mg/L時，生生脈組與生四君組存在顯著差異，數值上生四君組高于紅四君組，紅生脈組高于生生脈組，但各組之間沒有顯著差異。

3.4 各給藥組對小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α的影響[15]

腫瘤壞死因子（TNF-α）是由單核巨噬細胞產生的，對免疫系統有強有力的作用，促進機體免疫炎癥反應。本實驗結果表明，四君子湯與生脈飲能夠顯著的增加巨噬細胞上清液中TNF-α的含量；400mg/L為釋放TNF-α最佳給藥濃度，說明在400mg/L時，細胞活性達到最大，比較各組間數據，數值上生四君組高于紅四君組，紅生脈組高于生生脈組。

綜合以上，從實驗結果可以看出，各方劑組在400mg/L時促進巨噬細胞的作用最強，同劑量組間生四君、紅生脈效果優于替換后的方劑組，說明經典方劑在使用中的優越性與特定性，在使用的過程中應避免將生曬參與紅參互換代替的行為，才能最好的發揮人參在方劑中的作用。