擬南芥AT4G32010基因缺失突變體對非生物脅迫的響應

趙彥敏，甕巧云

（1.張家口廣播電視大學，河北 張家口 075000；2.河北北方學院農林科技學院，河北 張家口 075000）

干旱是農業生產中嚴重影響植物產量的重要逆境因子。提高植物的抗旱性已成為育種工作中迫切需要解決問題。在長期進化過程中，植物通過一系列代謝過程的改變、形成了一套應答機制。在植物抗逆境響應過程中，作為基因開關的轉錄因子（Transcription Factor，TF）發揮重要作用。植物中轉錄因子數量很多，部分成員參與到植物逆境調控過程中。

B3家族基因是植物中特有的轉錄因子，所有成員在結構組成中均含有1個B3－DNA結構域。該家族成員根據蛋白結構域和功能特征的不同分為ARF（Auxin Response Factor）、LAV（Leafy Cotyledon 2［LEC2］－Abscisic Acid Insensitive3［ABI3］－VAL）、REM（Reproductive Meristem）、HSI（High－level expression of sugarinducible gene）和 RAV（Related to ABI3/VP1）等亞族基因［1］。 迄今為止，擬南芥中存在118個B3基因，水稻中有91個B3基因、小立碗蘚有38個B3基因、白楊有38個B3基因等［2］。目前，擬南芥B3家族基因功能研究比較深入。該家族基因在種子發育、休眠過程、抗逆脅迫等多種過程中起重要作用。如參與種子發育過程中的有擬南芥FUS3（FUSCA3），LEC2（LEAFYCOTYLEDON2），ABI3（ABSCISIC ACID INSENSITIVE3）、ABI5 等基因［3－7］；擬南芥RAVs基因如RAV1、RAV1L和RAV2/TEM2等均對植物生長過程中起負調控作用，參與擬南芥對干旱、鹽等非生物的脅迫過程。而且，RAVs基因的轉錄活性受到植物脫落酸和蕓苔甾內酯激素的抑制［8，9］；擬南芥 HSI2 在抗旱脅迫過程中起負調控作用［10］；擬南芥 ARF1、ARF2、ARF5、ARF6 等家族基因在花器官的衰老和脫落過程、花器官成熟過程、極性生長和細胞擴增、側根形成和生長激素信號通路中均發揮重要作用［11－15］。

本研究中擬南芥AT4G32010基因含有1個B3－DNA結構域和1個CW鋅指蛋白，屬于HSI亞族基因。迄今為止，有關該基因功能鮮見報道。因此，本研究以擬南芥HSI基因純合突變體為材料，在模擬干旱的條件下研究該基因與擬南芥抗旱脅迫的關系，以期為研究擬南芥HSI基因功能、抗旱機制及改良植物抗旱性奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥 （Arabidopsis thaliana）野生型Col和AT4G32010基因缺失突變體hsi種子均購買于美國擬南芥種質資源中心 （The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）。

1.2 擬南芥的種植

擬南芥野生型Col、突變體hsi種子經3%NaClO消毒5 min后，用無菌水沖洗3～4次。然后播種于MS固體培養基上。4℃春化3～4 d，轉移至光照培養箱培養。培養條件為（21±2）℃，14 h光照/8 h黑暗，相對濕度 60%，光照度 200 μE/（m2·s）。

1.3 純合突變體的鑒定

以基因組DNA為模板，利用兩引物法檢測hsi突變純合體。根據 http：//signal.salk.edu 網站上提供的T－DNA插入位點信息，設計鑒定引物。引物分別為 LBb1.3 （5′－ATTTTGCCGATTTCGGAAC－3′）、LP（5′－CTGGAATGCTCTCCACTTCTG－3′）和 RP5（5′－CGCTGGAAAATCAAGATTTTG－3′）。 以 4 周齡擬南芥野生型Col－0和hsi突變體基因組DNA為模板進行PCR驗證。PCR反應體系包括：DNA 1 μL、引物各 1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，用 ddH2O 補足至 25 μL。 擴增程序：94 ℃，10 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72℃1 min，共35個循環；72℃10 min。

1.4 HSI基因表達分析

分別提取擬南芥Col－0及hsi突變體4周齡植株總RNA，并反轉錄合成第一鏈cDNA。以擬南芥ACTIN為內參，利用實時熒光定量法分析HSI基因的表達情況。基因特異性引物F（5′－GGCATCATCAAACGAAAAGC－3′）和 R（5′－GGTGTCTTGGATGCTTGGTC－3′）；內參引物 ACTIN2 F （5′－CTCC CGCTATGTATGTCGCC－3′）和 R（5′－CAGCAAGGTCAAGACGGAGG－3′）。熒光定量PCR反應體系的配制：2×PCR buffer 25 μL，Primers（25 pmol/μL）1 μL，Sybr green I 0.5 μL，模板 cDNA 2 μL，補水至 50 uL。熒光定量PCR擴增條件：94℃4 min；94℃20 s 60℃30 s 72℃30 s，循環35次；72℃檢測信號。

1.5 擬南芥植株對非生物脅迫的響應

擬南芥野生型Col－0及hsi突變體種子經表面消毒后， 分別點種到含有甘露醇（0、200、250、300 mmol/L）和含 NaCl（0、100、125、150 mmol/L）的 MS固體培養基上。培養7 d后統計種子萌芽率（以種子露白為準）；培養10d后進行根長度的測量。每個處理，重復3次。

2 結果與分析

2.1 擬南芥HSI基因結構分析和純合突變體鑒定

擬南芥HSI基因由12個外顯子和11個內含子組成。 根據 http：//signal.salk.edu 網站所提供的信息，可知擬南芥突變體hsi中T－DNA序列插入到HSI基因的第10個內含子（圖1）。

圖1 擬南芥hsi突變體T－DNA插入位點

由于T－DNA的片段較長，基因上的引物LP/RP不能將其所包含的DNA序列擴增出來。如果是突變純合子，只能借助T－DNA上的引物與基因上的引物LBb1.3/LP才能擴增出條帶，條帶大小約為500 bp；如果是突變雜合子，利用LBb1.3/LP和LP/RP 2對引物組合分別在DNA水平上可擴增出2個條帶，分別約為500、1 000 bp，與預期值相符。突變體鑒定結果如圖2所示，用 LB1.3＋LP引物組合，3個不同hsi突變體中均可擴增出長度約500 bp的條帶，野生型沒有擴增出條帶；利用LP＋RP引物組合擴增，3個不同hsi突變體未擴增獲得條帶，而野生型植株擴增獲得長度約1 000 bp的條帶。以上結果表明，3個不同突變體均為HSI基因的T－DNA插入純合突變體。

圖2 擬南芥hsi純合突變體PCR驗證結果

2.2 擬南芥植株HSI基因表達分析

利用實時熒光定量PCR技術，對初步鑒定的純合突變體進行HSI基因表達分析。結果如圖3所示，與野生型Col相比，突變體中HSI基因表達量明顯下降。將純合突變體種子進行單株單收。

圖3 擬南芥植株HSI基因表達分析

2.3 擬南芥植株對干旱脅迫的響應

由圖4可知，在模擬干旱條件下，擬南芥植株發芽率受到明顯的抑制。突變體hsi與野生型植株的發芽率均隨著甘露醇濃度的提高呈逐漸下降的趨勢。在不同濃度甘露醇脅迫下，突變體植株發芽率均明顯低于野生型植株。尤其是在300 mmol/L甘露醇處理時，兩者發芽率均達到最低（野生型為29.1%，突變體為19.1%）。在不同濃度甘露醇脅迫下，突變體hsi與野生型植株根長度變化不大。兩者根長度均隨著甘露醇濃度的增加而降低。僅在250 mmol/L甘露醇濃度時，突變體根長度高于野生型，差異明顯，其他3個濃度脅迫下，兩者根長度差異不明顯。

2.4 擬南芥植株對鹽脅迫的響應

在鹽脅迫下，擬南芥植株萌芽率受到明顯的抑制。突變體hsi與野生型植株的發芽率均隨著鹽濃度的提高而呈逐漸下降的趨勢。野生型植株發芽率下降變化不大，僅在150 mmol/L鹽濃度時發芽率下降到最低，達到74.2%。突變體hsi在鹽濃度為100 mmol/L時發芽率就下降到6.7%，與野生型差異明顯。 在125、150 mmol/L時降到最低，達到0.8%（圖5）。在鹽脅迫下，突變體hsi與野生型植株根長度均隨著鹽濃度的增加而呈降低的趨勢。同一鹽濃度下，突變體根長度低于野生型，但兩者差異不明顯（圖 5）。

圖4 擬南芥植株對干旱脅迫的響應

圖5 擬南芥植株對鹽脅迫的響應

3 結論和討論

利用基因工程進行植物抗旱性的改良是一種快速、有效的手段。目前，在水稻、小麥、玉米、擬南芥中克隆獲得很多抗旱、抗逆基因。利用轉基因技術已實現了對植物抗逆能力的改良，從而加速育種進程。如擬南芥轉基因CARAV1株系激活了體內PR相關基因的表達，提高了植株對病原菌的抗性和對高鹽、滲透脅迫的抗性［16］；Min 等［17］在玉米 H21 中克隆獲得含有AP2和B3結構域的ZmRAV1，定位于細胞核上。在干旱、鹽和脫落酸脅迫下ZmRAV1基因表達量增加。過表達ZmRAV1擬南芥植株提高了對鹽和滲透脅迫的耐受力。將擬南芥AtRAV1／2或AtABI5基因轉入棉花中，提高了植株抗旱能力，同時在光合作用、根長度和根面積方面均優于非轉基因植株［18］。

本研究獲得的擬南芥HSI基因是一個潛在的脅迫耐受候選功能基因。在模擬干旱和鹽脅迫條件下，突變體發芽率均低于野生型。表明該基因可以應答干旱、鹽脅迫的響應，且在種子萌發過程中起正調控作用。在根生長過程中發現，不同模擬干旱脅迫下，突變體和野生型根長度變化不同。在0、200、300 mmol／L甘露醇濃度下，突變體和野生型間根長度差異不明顯。僅在250 mmol／L甘露醇濃度下，突變體長度明顯高于野生型。不同鹽濃度脅迫下，野生型和突變體根長度下降，但兩者之間差異不明顯。表明該基因參與根的生長過程，關于其調控作用還需通過增加脅迫濃度、測量抗旱、抗鹽相關的生理指標等措施進一步研究。