50 Hz 1.8 mT正弦交變電磁場通過促進骨形成抑制尾吊大鼠的骨量丟失

李文苑 葸慧榮 高玉海 楊芳芳 陳克明

蘭州軍區蘭州總醫院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050

航天飛行是人類遇到的最極端的情況之一，宇航員在地球軌道以外的任務將需要長時間在微重力環境下生活和工作。據報道，每位宇航員在太空中損失大約1%的骨密度(bone mineral density，BMD)，這表明宇航員在任務期間或之后可能處于較高的骨折風險。更好地了解由這些因素引起的問題，可以最大限度地降低宇航員骨量丟失，提高骨質量從而幫助宇航員空間飛行順利[1-4]。

目前，骨質疏松的治療方法主要以藥物為主，但由于抗骨質疏松癥藥物的副作用及高成本[5-7]，安全無創生物物理刺激對預防和治療骨質疏松癥更有前景。據報道，正弦交變電磁(sinusoidal electromagnetic fields，SEMFs)能夠防止大鼠尾吊(hind-limb suspension，HLS)模型中模擬微重力引起的骨丟失[8]。地面上模擬空間微重力導致骨質疏松癥最受認可的動物模型之一是后肢懸吊模型。大鼠的尾吊模型可模擬在太空飛行期間生長的大鼠中的骨轉換和肌肉變化[9-10]，尾吊模型大大提高了微重力疾病研究的效率。本課題組前期研究發現，50 Hz 1.8 mT SEMFs可有效促進成骨細胞的分化及礦化成熟[11]。因此，本研究選用大鼠尾吊模型模擬空間微重力環境，探究50 Hz 1.8 mT正弦交變電磁場是否能抑制尾吊所致大鼠的骨量丟失，從而為電磁場治療骨質疏松癥的臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

雙能X線骨密度儀(GE公司，美國)，BX53型正置顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)，AG-X系列臺式電子萬能試驗機(島津公司，日本)，酶標儀(BioTeK公司，美國)，高分辨率活體顯微CT(Micro-CT SkyScan1176，比利時Bruker micro CT 公司)，SP1600硬組織切片機(德國Leica公司)。水合氯醛(天津大茂化學試劑公司，中國)，血清骨鈣素(osteocalcin，OC)試劑盒(上海研吉公司，中國)，抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRACP-5b)試劑盒(IDS Itd公司，英國)。

1.2 實驗動物及分組

6周齡SPF級SD雌性大鼠30只，體重(180±10)g，由甘肅省蘭州市獸醫研究所提供 [許可證號：SCXK(2015-0001)]，實驗開始前先訓養大鼠1 w，按照體重隨機分為3組，每組10只，分別為對照組、HLS組和HLS+SEMFs組。HLS+SEMFs組大鼠采用50 Hz 1.8 mT正弦交變電磁場每天干預1.5 h，期間大鼠仍然保持后肢懸空。大鼠飼養溫度(22±2)℃，濕度50%～70%。實驗期間大鼠自由進水進食，每周監測一次大鼠體重。

1.3 雙能X射線骨密度儀檢測大鼠骨密度

尾吊大鼠在50 Hz 1.8 mT 正弦電磁場下治療4 w后，處死全部大鼠，剝離主要器官固定于10%甲醛溶液中。剝離股骨、脛骨和椎骨，用0.9%NaCl浸泡過的紗布包裹，于-20 ℃保存。檢測前將凍存于-20 ℃冰箱中的椎骨和股骨在室溫下自發解凍。通過雙能X射線吸收測定法檢測股骨和椎骨的BMD。

1.4 生物力學檢測

椎骨和右側股骨用浸透了0.9%NaCl溶液的紗布包裹后置于-80 ℃凍存，臨用前自然解凍。股骨置于AG-IS型萬能試驗機上進行三點彎曲測試，跨距14 mm，加載速度10 mm/min，計算機記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量等。取大鼠第4腰椎骨(L4)用于壓縮實驗，將椎體兩面的椎間盤及軟組織切除，用砂紙將椎骨打磨成上下兩個面平行的圓柱體，將圓柱體垂直放置于不銹鋼平臺上，逐漸加載壓力，加載速度為2 mm/min，記錄載荷變形曲線，獲得最大載荷、彈性模量等。

1.5 血清生化指標分析

大鼠麻醉后自腹主動脈抽取血樣，靜置10 min，5000 r/min離心10 min，取上層血清凍存于-80 ℃中。骨形成指標檢測OC，骨吸收指標檢測TRACP-5b，均采用丹麥IDS公司生產的試劑盒。按說明書制作各自標準曲線，計算出樣品中OC和TRACP-5b的含量，單位分別為ng/mL和U/L。

1.6 Micro-CT分析

將大鼠股骨用顯微CT成像后分析，分析區域選在骨骺線下方5 mm處。用顯微CT軟件對所選區域進行三維重建，得出三維重建效果圖及股骨最大縱剖面圖。同時對股骨松質骨的骨微結構進行骨形態參數分析，包括BMD、骨表面積比體積(bone surface/ volume，BS/BV)、松質骨體積(bone/tissue volume，BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨小梁離散程度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.7 骨形態計量學指標分析

圖2 各組大鼠離體骨密度。A：股骨離體骨密度；B：椎骨離體骨密度Fig.2 Bone mineral density of rats in each group. A：Bone mineral density of the femur；B：Bone mineral density of vertebrae

采用不脫鈣骨組織切片法進行骨形態計量學分析[11]。新鮮分離的左側股骨用4%多聚甲醛固定后，梯度濃度乙醇脫水，過渡至二甲苯中，隨后浸入以40%甲基丙烯酸甲酯、10%鄰苯二甲酸二丁酯和50%二甲苯配成的1號液，80%甲基丙烯酸甲酯、20%鄰苯二甲酸二丁酯配成的2號液，80%甲基丙烯酸甲酯、20%鄰苯二甲酸二丁酯和20 g過氧化苯甲酰配成的3號液中各7 d，最后用80%甲基丙烯酸甲酯、20%鄰苯二甲酸二丁酯和60 g過氧化苯甲酰配成的4號液包埋。將包埋好的骨組織用LEICA SP1600鋸式切片機切成約50 μm的骨片，用502膠水將骨片封固于載玻片上，用1200～2000目砂紙打磨至顯微鏡下可見的厚度，然后用Van Gilson方法(VG染色)染色。簡言之，60 ℃亞甲藍染色5～8 min，洗滌不褪色，苦味酸品紅染色15 min，然后在光學顯微鏡下觀察染色切片，成像靜態組織形態計量分析。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th。

1.8 臟器系數分析

大鼠處死后，分離心臟、肝臟、腎臟和肺臟等器官，并將其周圍的脂肪組織剝離，稱量每個器官的重量。計算器官指數(器官指數=器官重量/大鼠體重×100%)，用10%甲醛溶液固定內臟。將器官石蠟包埋切片，HE染色進行毒理學分析，評價電磁場的副作用。

1.9 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，計量數據用均數±標準差表示，不同組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。每個變量用3組進行測試，每個實驗重復3次，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體重變化結果

如圖1所示，與正常對照組相比，各實驗組大鼠體質量差異均無統計學意義(P>0.05)，說明尾吊以及磁場干預對大鼠體質量沒有明顯的影響。

圖1 各組大鼠體重Fig.1 The body weight of each group

2.2 大鼠離體骨密度檢測結果

與正常對照組相比，HLS組股骨和椎骨骨密度顯著下降(P<0.01，P<0.01)，與HLS組相比，治療組股骨和椎骨骨密度顯著升高(P<0.05，P<0.01)，說明尾吊后大鼠的骨密度明顯下降，而1.5 h正弦電磁場治療對尾吊大鼠骨密度有一定提高。見圖2。

2.3 大鼠股骨三點彎曲和椎骨壓縮實驗結果

與對照組相比，HLS組股骨和椎體的最大載荷和彈性模量值均顯著降低(P<0.01)；與HLS相比，HLS+SEMFs組股骨最大載荷值顯著升高(P<0.05)，而彈性模量差異無統計學意義(P>0.05)；與HLS相比，HLS+SEMFs組椎骨彈性模量值顯著升高(P<0.05)，而最大載荷值差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠股骨三點彎曲和椎骨壓縮實驗。A：股骨彈性模量；B：股骨最大載荷值；C：椎骨彈性模量；D：椎骨最大載荷值Fig.3 Three-point femoral flexion and vertebral compression experiment. A: Modulus of elasticity of femur; B: Maximum load value of femur; C: Elastic modulus of vertebra; D: Maximum load value of vertebra

2.4 大鼠血清生化指標結果

圖4 各組大鼠血清生化指標比較。A：血清OC含量；B：血清TRACP-5b含量Fig.4 Serum biochemical markers in rats. A：The content of osteocalcin in serum；B：The content of tartrate-resistant acid phosphatase 5b in serum

HLS組和治療組血清OC(骨形成指標)相比于對照組顯著降低(P<0.01，P<0.05)，HLS+SEMFs 組OC值相比于HLS組顯著上升(P<0.01)；HLS組血清TRACP-5b濃度相比于對照組明顯升高(P<0.01)；與HLS組相比，HLS+SEMFs組TRACP-5b值明顯下降(P<0.01)，說明磁場的干預對提高大鼠OC水平和降低TRACP-5b水平均有一定影響。見圖4。

2.5 大鼠Micro-CT分析結果

各實驗組松質骨骨微結構的顯微CT圖像如圖5所示，與對照組相比，HLS大鼠的股骨顯示骨小梁數、骨小梁厚度、骨小梁面積顯著降低，分離度升高。SEMFs部分抑制小梁骨微結構的減少，相比HLS組骨小梁數、骨小梁厚度、骨小梁面積顯著升高，且分離度下降。如圖5B～5G所示，HLS導致骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th(P<0.01)顯著降低，BS/BV、Tb.Sp(P<0.01)明顯升高。SEMFs治療明顯提高松質骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th(P<0.01，P<0.05)，BS/BV、Tb.Sp則降低(P<0.01，P<0.05)。此外，對照組與HLS+SEMFs組相比BMD明顯升高(P<0.01)。50 Hz 1.8 mT正弦電磁場對大鼠松質骨BMD有明顯促進作用。

2.6 大鼠VG染色結果

圖5 各組大鼠Micro-CT分析Fig.5 Micro-CT analysis of rats in each group

圖6 各組大鼠VG染色及其結果Fig.6 Rat VG staining

4 w HLS大鼠正弦電磁場照射后，如圖6 A中VG染色顯示，HLS組與對照組相比，骨小梁數量和厚度明顯降低，分離度升高，SEMFs治療與HLS組相比，骨小梁數量和厚度增加，分離程度降低。定量結果顯示，對照組和HLS組之間骨小梁數目、骨小梁骨厚度和骨小梁分離度情況差異均有統計學意義(P<0.01)。SEMFs治療后與對照組相比，骨小梁數量和厚度增加(P<0.01，P<0.05)，分離程度降低(P<0.05)。

2.7 各組大鼠臟器病理學分析結果

HLS組大鼠和正弦治療組大鼠相比于對照組，臟器系數差異無統計學意義(P>0.05)，病理分析無異常，器官指數差異無統計學意義(P>0.05)，表明電磁場干預無毒副作用，見圖7。

3 討論

宇航員在空間飛行中骨密度明顯降低，已被證明會導致骨質疏松癥[12]。骨質疏松作為一種威脅人類健康的疾病，如何有效地治療及預防就變得至關重要。物理電磁法作為一種常用的治療方法，已被廣泛應用于臨床治療各種骨創傷。據報道，電磁場能夠在動物模型中改善尾吊引起的骨質疏松癥[8]，但是具體的作用機制尚未完全闡明。本研究采用大鼠進行尾吊，這種模型已被證明可以有效地造成大鼠骨質疏松。與失去正常負重活動或長期臥床的人類有相似之處的是，大鼠尾吊之后會破壞骨代謝的平衡，進而導致骨小梁丟失[13-14]，從而增加骨折風險。本實驗參考Zhou等[11]在細胞水平篩選出的最佳正弦交變電磁場參數(50 Hz 1.8 mT)對尾吊大鼠進行干預，通過對尾吊大鼠BMD、生物力學、血清生化、Micro-CT和骨組織形態學的研究，探討其作用機制，為臨床治療失重引起的骨質疏松的病理以及磁場治療機制提供有力幫助。

實驗期間，每周稱量大鼠的體重，大鼠體重趨勢反映了大鼠在飼養過程中的狀況，本實驗過程中各組大鼠體重均呈上升趨勢，各組間大鼠體重差異無統計學意義，生長狀況穩定。BMD作為評價骨強度的指標，通過檢測股骨和椎骨離體骨密度能夠準確地預測骨折發生的風險[15-16]，尾吊4 w后，與對照組大鼠相比，通過檢測可觀察到HLS組大鼠BMD顯著降低；與HLS組大鼠相比，SEMFs治療組的大鼠的BMD顯著增加。大量實驗結果顯示，SEMFs可以增加BMD，如股骨和椎骨的BMD。因此，1.5 h 50 Hz 1.8 mT的正弦電磁場可顯著提高大鼠的骨密度。骨的生物力學直接反映骨自身強度和韌性，它與骨骼中各種礦質含量和骨密度有關。電磁場可以顯著影響股骨和椎骨的骨密度，與此同時，它對于大鼠生物力學也會有一定影響。骨質疏松治療研究中常用的生物力學指標主要是最大載荷值和彈性模量，它們直觀反映大鼠骨骼整體的抗骨折能力。本實驗通過股骨和椎骨的生物力學實驗發現，SEMFs可以顯著增加骨骼的機械強度，抑制骨外在結構的惡化。經過課題組研究表明，SEMFs刺激能夠降低HLS大鼠松質骨的機械強度和結構的惡化，從而改善大鼠骨骼的整體生物力學性能。

骨骼能夠保持其正常結構和功能完整性，是由于成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收之間的動態平衡。生化指標體現體內的骨代謝水平，客觀地反映大鼠的骨吸收和骨形成。長期尾吊干擾大鼠骨代謝的穩態，導致骨形成減少和骨吸收增加[17-18]。實驗表明1.5 h 50 Hz 1.8 mT SEMFs干預可以顯著促進HLS組大鼠血清OC的分泌，對成骨細胞的生長有明顯促進作用。4 w尾吊導致骨吸收的血清標志物TRACP-5b顯著增加，SEMFs治療后對血清中TRACP-5b濃度有適度的抑制作用。因此，實驗結果表明，SEMFs具有一定提高成骨細胞形成和抑制破骨細胞形成的調節作用。

Micro-CT常用于骨小梁的研究，可以直觀地觀察大鼠松質骨骨微結構的變化。在大鼠股骨的Micro-CT觀察中，發現HLS大鼠骨小梁骨架結構明顯惡化，HLS導致骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低，但是BS/BV、Tb.Sp明顯升高。SEMFs干預4 w后能夠顯著抑制骨小梁微結構的惡化，提高骨質量。課題組的研究結果表明，SEMFs可以通過促進骨形成，部分治療尾吊大鼠的骨質量減少和骨微結構的惡化。

骨形態計量學指標是對骨微結構的重要評價指標，反映了機體組織形態學的變化。通過觀察SEMFs治療組與HLS組VG染色結果，可以發現骨小梁數量和厚度增加，分離程度低。組織形態學計量結果進一步證實了SEMFs在骨重塑中的調節作用，具有明顯的合成代謝和適度的抗再吸收作用。臟器系數是用來評價電磁場對實驗大鼠副作用的指標，本實驗中各組臟器系數相比于對照組差異均無統計學意義，病理學分析并無異常，說明電磁場對大鼠無毒性影響。

綜上所述，與對照組相比，4 w后各組大鼠體重均有增加，生長正常。治療組大鼠與對照組大鼠相比，通過骨密度、生物力學、血清生化檢測、Micro-CT和組織形態測定結果證明，50 Hz 1.8 mT正弦電磁場照射1.5 h可以促進尾吊大鼠的骨骼合成代謝活動，部分提高尾吊大鼠的骨質量、骨微結構和生物力學強度。本課題組的實驗更加明確地證明了SEMFs作為一種安全高效的骨質疏松癥治療方式，可以用于空間飛行中宇航員骨量丟失的臨床治療。