不同劑量和作用時間地塞米松對大鼠骨密度和成骨細胞作用的研究

吳麗婷 蔡勁薇 潘吉銘 伍龍果 梁敏

廣西醫科大學第一附屬醫院內分泌科, 廣西 南寧 530021

隨著糖皮質激素的廣泛應用，糖皮質激素性骨質疏松已經成為了最常見的繼發性骨質疏松，以骨量快速丟失及骨折風險增加為特征[1-2]。風濕病患者使用糖皮質激素治療后骨折風險明顯增高[3-4]，使用超生理劑量糖皮質激素治療超過90天的患者骨密度(bone mineral density, BMD)明顯下降，骨折風險增加[5]。研究認為在使用糖皮質激素初期，患者骨量丟失及骨折風險較長期持續使用糖皮質繼續的患者高[6]，另一項對使用吸入性糖皮質激素治療≥1年的兒童與成人哮喘患者的研究發現，患者骨密度和骨折風險并無增加[7]。目前關于糖皮質激素應用劑量及療程對骨骼代謝的影響尚有爭議，本研究通過探討不同劑量地塞米松干預不同時間對大鼠全身BMD及成骨細胞骨形成的作用，來闡明糖皮質激素劑量、療程對骨代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

3月齡雌性SPF級SD大鼠120只，購于廣西醫科大學實驗中心，合格證號：SYXK 桂 2014-0003， 體質量210～250 g。按隨機數字表法分為對照組(生理鹽水組)、小劑量Dex組(Dex 1 mg/kg組)、中劑量Dex組(Dex 2.5 mg/kg組)、高劑量Dex組(Dex 5 mg/kg),每組30只。對照組肌內注射生理鹽水，實驗組分別肌內注射1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg的Dex,左右肢交替注射，2次/周，分別干預4 w、9 w、12 w。廣西醫科大學實驗動物飼養房飼養，溫度(22±1) ℃，濕度59%～61%，日夜晝律為12 h，自由攝食進水。

1.2 骨密度測定

使用PLODIGY型(Lunar公司)雙能X線骨密度儀附帶的小動物軟件測定大鼠骨密度。干預前及干預后4 w、9 w、12 w，腹腔注射10%的水合氯醛3 mL/kg麻醉后測定大鼠全身骨密度。

1.3 免疫組化法檢測骨組織ALP、I型膠原蛋白表達

干預4 w、9 w、12 w后處死大鼠，快速取右側股骨近干骺端1/3部分，4%多聚甲醛(含1‰DEPC)固定24 h，每周2次更換10%EDTA脫鈣液，共6周。脫鈣結束后免疫組化SABC法檢測ALP蛋白表達，顯微鏡(OLYMPUS BX53)下觀察并選取3個視野，使用Image-ProPlus 圖像分析系統分析陽性細胞數情況，并計算平均光密度值。

1.4 成骨細胞分離培養及鑒定

出生24 h的SD大鼠乳鼠(廣西醫科大學動物實驗中心提供)顱骨中提取成骨細胞，采用酶消化法提取原代成骨細胞，差速粘附法去除成纖維細胞。分離的成骨細胞24 h貼壁生長，倒置顯微鏡下觀察成骨細胞呈紡錘形，多邊形，長梭形，包漿豐富，核仁清晰，含有1個明顯核仁，有數個細胞突起，隨著培養時間延長，成骨細胞規律性排列，呈放射性生長，符合成骨細胞的形態。采用堿性磷酸酶重氮鹽染色法鑒定成骨細胞，發現細胞內有棕黑色細微顆粒，細胞陽性率95%，用PBS 代替底物的陰性對照中的細胞內無黑色顆粒。采用茜素紅染色法鈣結節結果提示分離的成骨細胞經茜素紅染色呈橙紅色。通過細胞形態觀察、堿性磷酸酶染色和鈣結節染色，證明分離培養的細胞具有成骨細胞的形態特征和分泌堿性磷酸酶、形成鈣結節的生物學行為。

1.5 實驗分組及處理

純化的原代成骨細胞按每毫升2×104個細胞的密度接種96孔板，每孔100 μL，設置6個復孔。培養24 h待細胞貼壁后對細胞進行換液，并加入含有不同濃度(5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L)Dex的培養液100 μL干預成骨細胞12 h、24 h、48 h，對照組給予等體積培養液，空白組加入等量的PBS，一般位于96孔板的4 w。

1.6 CCK-8檢測成骨細胞增殖

培養結束時每孔加入cck8 10 μL，37 ℃培養箱避光孵育1 h后用酶標儀測每孔的吸光值，空白組一般設為96孔培養板四周的PBS孔。避光孵育1 h后，將孔板置于酶標儀上，選擇450 nm波長處測各孔吸收度，結果用A450表示。計算時將每個Dex藥物濃度組細胞的6個復孔值去掉一個最大數值，去掉一個最小數值，剩余的4個數值取平均值表示該Dex藥物干預組的吸光值。

1.7 RT-PCR檢測成骨細胞ALP和I型膠原基因的表達

純化的成骨細胞培養一定時間后，Trizol Reagent(美國Invitrogen 公司)提取細胞總RNA。采用一步法RT-PCR 試劑盒(日本Takara 公司)檢測細胞ALP mRNA 表達。內參β-actin 和ALP 序列為:

ALP 上游序列：CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA；

下游序列：CCTTGTAACCAGGCCCGTTG，擴增長度158 bp。

I型膠原 上游序列：GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC；

下游序列：GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA，擴增長度119 bp。

β-actin 上游序列：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG

下游序列：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA，擴增長度143 bp。

PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15S，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環。

1.8 主要試劑

地塞米松磷酸鈉注射液(1 mL∶ 5 mg，廣東三才石岐制藥有限公司)，大鼠麻醉劑(10% 的水合氯醛)，地塞米松(Sigma),焦炭酸二乙酯(DEPC)，Trizol (Invitrogen 公司)，逆轉錄試劑盒(Fermentas)，DreamTaq Green PCR Master Mix (TaKaRa寶生物公司)，免疫組化染色試劑盒(KIT-7720，邁新)，CCK8試劑盒(日本同仁)。PCR 引物: 根據Gene Bank 中大鼠ALP、I型膠原(內參) 的基因序列設計引物，由寶生物工程(大連) 有限公司設計并合成。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 Dex對大鼠骨密度的影響

干預4 w，不同劑量Dex 組大鼠全身BMD與對照組相比均無差異(P>0.05)。干預9 w，不同劑量Dex 組大鼠全身BMD均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，高劑量組大鼠BMD明顯低于小劑量組(P<0.05)。干預12 w，不同劑量Dex 組大鼠BMD均低于對照組(P<0.05)，高劑量組BMD明顯低于中劑量和小劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 不同劑量地塞米松組大鼠干預前后全身骨密度的比較Table 1 Comparison of BMD among the four groups before and after Dex intervention g/cm2)

注：▲與對照組相比P<0.05，#與高劑量組比較,P<0.05。

2.2 Dex對骨組織ALP和I型膠原蛋白表達的影響

干預4 w，不同劑量Dex 組大鼠骨組織ALP與I型膠原蛋白表達與對照組均無差異(P>0.05)，見圖1。干預9 w，小劑量Dex組大鼠骨組織I型膠原蛋白表達與對照組無差異(P>0.05)，ALP蛋白表達低于對照組(P<0.05)；中劑量和高劑量Dex 組骨組織的ALP及I型膠原蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，見圖2。干預12 w，不同劑量Dex組大鼠骨組織ALP及I型膠原蛋白表達均明顯低于對照組(P<0.05)，高劑量Dex 組骨組織的ALP、I型膠原蛋白表達顯著低于中劑量和小劑量組(P<0.05),見圖3。

2.3 Dex對體外分離培養的成骨細胞增殖的影響

分別采用5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L Dex作用于成骨細胞12 h、24 h及48 h。干預12 h，與空白對照組比較，5×10-6mol/L和5×10-5mol/L Dex均抑制成骨細胞的增殖(P<0.05)，見表2；干預24 h及48 h后，不同濃度Dex均抑制成骨細胞的增殖(P<0.05)，干預同一時間，成骨細胞增殖率隨著Dex濃度的增加而下降，呈濃度依賴性，見表2；同一濃度Dex作用下，隨著干預時間的延長，成骨細胞增殖率逐漸下降，呈時間依賴性，見圖4。

圖1 干預4 w后ALP、I型膠原蛋白在不同劑量Dex組的表達(×200)Fig.1 Expression of ALP and type I collagen protein in different groups after treated with Dex for 4 weeks (×200).

圖2 干預9 w后ALP、I型膠原蛋白在不同劑量Dex組的表達(×200)Fig.2 Expression of ALP and type I collagen protein in different groups after treated with Dex for 9 weeks (×200).

圖3 干預12 w后ALP、I型膠原蛋白在不同劑量Dex組的表達(×200)Fig.3 Expression of ALP and type I collagen protein in different groups after treated Dex for 12 weeks (×200).

表2 不同濃度的Dex干預不同時間對成骨細胞增殖的影響Table 2 Effect of different concentrations of Dex on osteoblast proliferation in different courses.

注：*表示同一作用時間點的不同濃度地塞米松藥物與空白對照比較，P<0.05。

圖4 不同濃度的Dex干預不同時間對成骨細胞增殖率的變化Fig.4 Effect of different concentrations of Dex on osteoblast proliferation in different courses.

圖5 不同濃度Dex干預不同時間對成骨細胞ALP mRNA表達的影響(與對照組相比)Fig.5 Effect of different concentrations of Dex on the expression of ALP mRNA in different courses (compared with the control group).

圖6 不同濃度的Dex干預不同時間對成骨細胞骨形成指標 I型膠原mRNA表達的影響(與對照組相比)Fig.6 Effect of different concentrations of Dex on the expression of type I collagen mRNA in different courses (compared with the control group)

2.4 Dex對體外分離培養的成骨細胞ALP、I型膠原 mRNA表達的影響

分別采用5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L Dex作用于成骨細胞12 h,24 h及48 h。干預12 h，與對照組相比，5×10-8mol/L Dex組成骨細胞ALP mRNA表達與對照組無差異(P>0.05)；隨著Dex濃度的增加，ALP mRNA的表達逐漸降低(P<0.05)，以5×10-5mol/L Dex組的成骨細胞ALP mRNA下降最明顯(P<0.001)，呈濃度依賴性,見圖5；干預12 h，與對照組相比，5×10-5mol/L Dex組成骨細胞I型膠原mRNA表達低于對照組(P<0.05),其余濃度Dex組與對照組比較均無差異(P>0.05)，見圖6。干預24 h及48 h,不同濃度Dex組成骨細胞ALP、I型膠原 mRNA表達均低于對照組(P<0.05)，在同一干預時間隨著Dex的濃度增加，ALP及I型膠原 mRNA的表達逐漸降低(P<0.05),呈濃度依賴性，見圖5～6。進一步觀察Dex作用時間對ALP、I型膠原mRNA的影響，除5×10-8mol/L Dex組外，其他濃度Dex組均隨著干預時間的延長，ALP及I型膠原 mRNA的表達均逐漸降低，以48 h時間點的抑制作用最強，呈時間依賴性(見圖7～8)。

圖7 同一濃度Dex干預不同時間對成骨細胞ALP mRNA表達的影響(*表示與對照組比較，P<0.05)Fig.7 Effect of the same concentration of Dex on the expression of ALP mRNA in different courses (*：Compared with the control group, P<0.05).

圖8 同一濃度的Dex干預不同的時間對成骨細胞 I型膠原mRNA表達的影響(*表示與對照組比較，P<0.05)Fig.8 Effect of the same concentration of Dex on the expression of type I collagen mRNA (*： Compared with the control group, P<0.05)

3 討論

GIOP作為第一位醫源性所致的骨質疏松[8]，可致骨量減少和骨微結構破壞，易發生脆性骨折[9]。糖皮質激素應用的劑量、時間、給藥方式等均可能會對骨骼有不同影響，研究發現在多發性硬化癥患者短期內應用大劑量糖皮質激素并未出現骨密度降低[10]，長期應用糖皮質激素可導致骨吸收增加及骨形成減少，加快骨量丟失，出現骨密度下降[11]。本課題組前期以2.5 mg/kg Dex每周2次肌注，4 w后不同劑量Dex組大鼠骨密度與對照組相比無差異，9 w后各組大鼠骨密度均下降[12]。Ogoshi等[13]分別使用2 mg/(kg·d)及20 mg/(kg·d)的潑尼松龍對3月齡大鼠干預4 w，結果顯示大鼠的骨小梁及皮質骨BMD并未下降。本研究結果也顯示，Dex干預4 w內大鼠全身骨密度并未下降，骨形成無減少，這與本課題組前期發現是一致的[14]，說明短期內Dex對大鼠的骨形成并未產生抑制作用，全身骨量無明顯丟失。糖皮質激素對骨代謝影響有著強烈的時間、劑量依賴性[15]，隨著干預時間的延長，各劑量Dex均可導致大鼠全身BMD下降，骨形成明顯減少，高劑量Dex 導致骨密度下降幅度及對骨形成的抑制作用均明顯強于小劑量及中劑量Dex，本研究結果也表明糖皮質激素對骨形成及骨密度影響呈現時間和劑量依賴性，長期及大劑量應用糖皮質激素對骨形成抑制作用更強，骨密度明顯下降。這也與“糖皮質激素并沒有最低的安全劑量”觀點是相符合的[16]。

有研究發現，糖皮質激素可抑制成骨細胞增殖[17]，在10-9mol/L～10-5mol/L Dex干預24 h后，成骨細胞增殖隨著濃度的增加而減少[18]；國內研究也發現使用不同濃度Dex(10- 7mol/L、5×10- 8mol/L、10- 8mol/L)培養成骨細胞96 h后，在5×10- 8mol/L 和10- 7mol/L 濃度的Dex可抑制成骨細胞骨鈣素基因表達和細胞增殖[19]。 在高濃度Dex作用下，成骨細胞的成脂活性增強，成骨細胞的增殖、骨形成活性明顯受到抑制[20]。本研究結果與上述研究相似，僅干預12 h，最低濃度(5×10-8mol/L) Dex對成骨細胞增殖及骨形成并無抑制作用，但高濃度(5×10-5mol/L)Dex可抑制成骨細胞的增殖及骨形成；Dex干預24 h后，成骨細胞增殖和ALP、I型膠原mRNA 表達均呈濃度依賴性降低，表明短期內低劑量的Dex對成骨細胞增殖及骨形成未產生抑制作用，但隨著劑量和時間的增加，Dex 對成骨細胞增殖及骨形成的抑制作用越來越強。而研究也發現，使用10-9mol/L～10-6mol/L濃度Dex干預骨髓間充質干細胞，ALP活性隨著時間和濃度的增加越來越低，在干預最長時間及最高濃度時骨形成作用最弱[21]，說明糖皮質激素呈時間和濃度依賴性地抑制成骨細胞增殖及骨形成作用。

綜上所述，短時間、小劑量的Dex 對大鼠骨密度和骨形成無不良影響，但長期、高劑量的Dex可明顯抑制成骨細胞增殖和骨形成，降低骨密度，導致了糖皮質激素性骨質疏松的發生。