雌激素對去勢骨質疏松癥大鼠骨密度和骨代謝影響的實驗研究

許閆嚴 張克良 魏忠民 沈波

武漢市第四醫院 華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院西院骨一科，湖北 武漢 430000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與年齡、性別、環境、遺傳等相關的退行性疾病。女性絕經后患骨質疏松癥的概率要遠大于男性，主要是由于雌激素缺乏所導致[1]。雌激素的缺乏將導致患者骨代謝紊亂、破骨細胞分化因子增加、未成熟的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)增多及骨髓間充質干細胞減少，這些變化最終導致骨吸收與骨生成平衡被打破，造成骨微結構破壞、骨量減少、骨強度下降，從而導致骨質疏松[2-4]，據此越來越多的學者通過摘除卵巢的方法來制備骨質疏松癥動物模型[5-6]。在臨床研究中，對雌激素治療絕經后女性骨質疏松癥的研究大多僅限于臨床療效的觀察上。例如，黎濤等[7]使用雌激素聯合抗骨質疏松藥物治療絕經后女性骨質疏松癥具有顯著的臨床療效。而相關作用機制研究鮮有報道，尤其是骨密度(bone mineral density，BMD)和骨代謝方面。因此，筆者于2015年9月至2016年3月利用去卵巢骨質疏松癥模型的大鼠進行研究，旨在通過補充雌激素的刺激作用，觀察其對去卵巢骨質疏松癥模型大鼠骨密度和骨代謝的影響，探討雌激素治療絕經后女性骨質疏松癥的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組與造模

所有動物實驗嚴格遵守實驗動物倫理條例。選用雌性健康的SD大鼠48只，鼠齡5～6個月，體重(245±24)g，未曾交配，購自于湖北省實驗動物中心。將SD大鼠隨機分成4組：對照組(12只)、模型組(12只)、雌激素組(12只)和雌激素+三苯氧胺組(12只)。對照組，即假手術組，在手術過程中只暴露卵巢而不切除，隨后立即進行縫合處理；其他各組大鼠采用雙側卵巢摘除法制備骨質疏松癥模型。手術方法：使用3%戊巴比妥(注射量按大鼠體質量計算)腹腔注射麻醉處理，沿背部正中左右兩側軟肋下剪開皮膚，切口長約2.0 cm，向一側分離皮膚筋膜及腹膜臟層，暴露腹腔，找到子宮后確認雙側卵巢。對照組保留雙側卵巢，其他各組大鼠進行結扎及摘除兩側整個卵巢組織，分層縫合后，外層皮膚消毒。手術過程中無大鼠死亡，術后所有大鼠均臀部肌肉注射青霉素(200萬U/kg)預防術后感染，注射3 d，每日1次，手術后自由攝食和攝水。

1.2 給藥及取材

手術一個月后開始給藥。雌激素組給予尼爾雌醇(北京四環制藥有限公司)灌胃(按體質量計)，用藥劑量[8]為1 mg/kg，生理鹽水配制，1次/w；雌激素+三苯氧胺組給予尼爾雌醇(1 mg/kg)和三苯氧胺(山東健康藥業有限公司，用藥劑量[9]為3 mg/kg)灌胃，生理鹽水配制，1次/w；對照組和模型組分別使用等量生理鹽水灌胃。持續3個月，每周稱量體重1次，并按照體重變化調整給藥量。給藥前每組隨機采用10%水合氯醛(3 mL/kg)注射麻醉6只大鼠，分別取血及剝離脛骨及股骨組織保存。給藥3個月后，對剩下所有大鼠(每組6只)進行一次眼球取血3～5 mL，-20 ℃保存。取血后，10%水合氯醛注射麻醉(3 mL/kg)，在無菌條件下取大鼠右后肢脛骨及股骨干骺端，剝離附著的肌肉及解體組織，充分暴露股骨頭，用消毒后的老虎鉗將脛骨、股骨頭鉗碎，分別放入無菌的EP管中，-80 ℃保存。

1.3 指標檢測

1.3.1血清生化指標的測定：取血液3 mL，3 000 r/min 離心15 min，取血清。采用原子吸收分光光度計測定血清鈣含量；采用酶聯免疫法測血清總堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRAP-5b)的含量，ALP及TRAP檢測試劑盒均由上海生工提供。

1.3.2骨骼鈣的測定：取右后腿脛骨并剝離附著在脛骨上面的肌肉及解體組織，將骨頭置于90 ℃烘箱中烘5～6 h后，碾碎并稱其質量(約1 g)，緩慢將碾碎的脛骨置于刻度均一的離心管中，加入8 mL硝酸，放置于搖床(低速)上過夜，將95 ℃水浴鍋中加熱至溶液清澈透明，用超純水定容至50 mL。取樣品1 mL稀釋1 000倍，測定骨骼中鈣的含量。

1.3.3骨礦物鹽含量的測定：將大鼠股骨放入烤箱，105 ℃烤干至恒重后稱量為干重，烤干后的樣品放入灰化爐650 ℃灰化 36 h，取出稱量為灰分重量，礦鹽含量為灰分重量與干重之比。

1.3.4骨保護素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)蛋白表達的檢測：將大鼠左側脛骨組織進行常規脫鈣，包埋、切片、脫蠟、用雙氧水滅活內源性酶，進行高溫高壓修復3 min，山羊血清封閉液室溫封閉1 h，滴加OPG(CST，1∶100)及RANKL(CST，1∶100)一抗孵育過夜，滴加生物素二抗室溫孵育2 h，滴加鏈霉親和素-生物素復合物試劑，二氨基聯苯胺顯色后，蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。細胞胞漿著色呈現棕黃色為陽性表達，每張切片隨機選取10個視野，采用圖像分析系統測定著色部位的平均光密度值，作為OPG及RANKL蛋白的表達強度。

1.3.5骨密度的測定：使用美國GE公司生產的LunarDPX-Prodigy雙能X線骨密度測量儀測定大鼠左側股骨的骨密度值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠血清鈣及骨骼鈣含量的檢測結果

給藥前與對照組比較，模型組、雌激素組和雌激素+三苯氧胺組血鈣含量顯著升高(P<0.05)，骨鈣含量顯著降低(P<0.05)。給藥治療后與給藥前比較，雌激素組血鈣含量顯著降低(P<0.05)，骨鈣含量顯著上升(P<0.05)，模型組和雌激素+三苯氧胺組差異無統計學意義(P>0.05)。給藥后與模型組比較，雌激素組血鈣含量顯著降低(P<0.05)，骨鈣含量顯著上升(P<0.05)，而雌激素+三苯氧胺組差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清鈣、骨骼鈣給藥前后含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05；給藥后與給藥前相比較，▲P<0.05。

2.2 大鼠骨代謝相關生化指標的檢測結果

給藥前與對照組比較，模型組、雌激素組和雌激素+三苯氧胺組血清ALP含量差異無統計學意義(P>0.05)，血清TRAP-5b含量顯著升高(P<0.05)。給藥治療后與給藥前比較，雌激素組血清ALP含量顯著升高(P<0.05)，TRAP-5b含量顯著降低(P<0.05)，模型組和雌激素+三苯氧胺組差異無統計學意義(P>0.05)。給藥后與模型組比較，雌激素組血清ALP含量顯著升高(P<0.05)，TRAP-5b含量顯著降低(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺組差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠給藥前后骨代謝生化指標比較

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05；給藥后與給藥前相比較，▲P<0.05。

2.3 各組大鼠股骨骨密度及骨礦物鹽含量的檢測結果

給藥前與對照組比較，模型組、雌激素組和雌激素+三苯氧胺組BMD和骨礦物鹽含量顯著降低(P<0.05)。給藥后與給藥前比較，雌激素組BMD和骨礦物鹽含量顯著升高(P<0.05)，模型組BMD和骨礦物鹽含量則繼續顯著降低(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺組差異無統計學意義(P>0.05)。治療后與模型組比較，雌激素組BMD和骨礦物鹽含量顯著升高(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺組BMD和骨礦物鹽含量差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠給藥前后左側股骨BMD值和骨礦物鹽含量比較

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05；給藥后與給藥前相比較，▲P<0.05。

2.4 大鼠脛骨中OPG和RANKL蛋白表達測定

與對照組比較，模型組和雌激素+三苯氧胺組OPG蛋白顯著下調(P<0.05)，RANKL蛋白顯著升高(P<0.05)；雌激素組OPG蛋白和RANKL蛋白則無顯著性變化。與模型組比較，雌激素組OPG蛋白顯著升高(P<0.05)，RANKL蛋白顯著降低(P<0.05)；而雌激素+三苯氧胺組OPG蛋白和RANKL蛋白則無顯著性變化(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠脛骨OPG和RANKL蛋白表達平均光密度值比較Table 4 Comparison of the mean optical density of OPG and RANKL protein expression between

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05。

3 討論

去卵巢后大鼠所引起的生理學上的變化與絕經后婦女相似，而這一變化主要是由于體內雌激素缺乏所致。有研究表明，當雌激素缺乏時會引起骨中鈣的結合能力減弱，導致破骨細胞的吸收作用增強，骨質丟失速度加快，引起骨量減少[10]，最終導致骨質疏松癥的發生，而這些也是導致絕經后女性人群骨質疏松癥高發的一個重要原因。據2009年一項流行病學調查結果顯示[11]，絕經后女性發生骨質疏松的概率為9.4%～37.9%，遠高于絕經前女性的1.8%～3.2%。通過補充雌激素治療絕經后女性骨質疏松癥或許是一個潛在的治療方法，早在1972年Aitken等[12]就在動物模型中嘗試使用雌激素治療骨質疏松癥，發現雌激素能夠促進新骨的形成。現如今，雌激素類藥物在骨質疏松的治療中被廣泛運用，并具有一定的療效。

現代醫學認為絕經后骨質疏松癥是因雌激素匱乏導致骨重建失衡引起的高轉換型代謝性骨疾病。有研究表明[13]，雌激素缺乏可導致成骨細胞和破骨細胞的比例失衡，骨吸收作用增強，骨形成減少，最終導致骨量丟失。本研究的結果顯示，與對照組比較，去勢骨質疏松癥模型大鼠血鈣含量明顯增加，骨鈣含量顯著減少。經過雌激素治療后，大鼠血鈣含量則顯著降低，骨鈣含量明顯增加，而采用雌激素受體拮抗劑三苯氧胺與雌激素灌胃治療并未顯著降低血鈣含量和顯著增加骨鈣含量。且治療后雌激素組大鼠與骨吸收相關標志物TRAP-5b水平顯著低于模型組，骨形成標志物ALP則顯著高于模型組，而雌激素+三苯氧胺組與模型組比較差異無統計學意義。說明雌激素治療可以通過阻止去勢骨質疏松癥大鼠骨骼鈣的流失，從而促進骨形成。治療后與治療前比較，模型組中ALP水平也呈現上升趨勢，根據骨代謝中骨吸收增加與骨形成動態平衡原理，可能是由于骨吸收的增強而導致的代償性骨形成增加所致[14]。另外，骨密度和骨礦物鹽含量的檢測結果顯示，模型組大鼠的股骨骨密度和骨礦物質鹽含量顯著低于對照組，而雌激素治療后，能夠顯著提高大鼠股骨骨密度和骨礦物質鹽含量，但雌激素+三苯氧胺組則未顯著提高大鼠股骨骨密度和骨礦物質鹽含量。說明雌激素對提高骨密度和防止骨礦物鹽流失具有極大的促進作用。

OPG/RANKL/RANK信號系統是破骨細胞分化成熟過程中的調控樞紐和關鍵的信號途徑[15]，RANK和RANKL結合可導致破骨細胞前體分化和成熟，而OPG能夠和RANK競爭性地結合RANKL，間接地降低破骨細胞的活性和分化，在骨量調節中起著重要的作用[16-17]。本研究結果顯示雌激素組大鼠骨中OPG蛋白表達量要高于模型組，而RANKL蛋白表達量則低于模型組，而雌激素+三苯氧胺組與模型組比較，OPG和RANKL蛋白表達無顯著性變化。這充分說明雌激素能夠提高OPG蛋白表達，有利于與RANKL競爭性結合，降低破骨細胞的活性和分化，對抑制骨質疏松的形成起著重要作用。

本研究充分說明雌激素可以通過提高骨密度及骨礦物含量，降低骨轉化，對去勢骨質疏松癥的治療具有明顯的療效。但本研究還存在不足之處，例如本研究的實驗對象僅為雌性去勢SD大鼠，存在一定的局限性；且有研究表明長期應用雌激素會對子宮等骨骼外的器官造成不良影響，可導致子宮內膜癌等生殖系統癌癥[18]，使雌激素在骨質疏松癥的治療上蒙上了一層陰影。因此，為了讓雌激素更好地應用于骨質疏松癥的治療，還需要更多的探索。