積雪草酸對高血脂小鼠骨量丟失的保護作用

吳少科 陳曉駟 孫欣 陳海聰 林柏云 鐘環 胡資兵* 魏波 孫文皋

1. 廣東醫科大學附屬醫院骨外科，廣東 湛江 524023 2. 廣東醫科大學附屬醫院VIP病區，廣東 湛江 524023

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝性疾病，其特征是低骨量、骨強度下降、骨折風險性增加。高脂血癥是指一種發病隱匿的、進行性和全身性疾病，表現為總膽固醇過高、甘油三酯過高或兩者兼有，在中國成年人的人群里，其發病率約為41.9%[1]。有研究表明，骨量丟失或骨質疏松的患者常常伴隨著高血脂[2]，去卵巢的大鼠或絕經后的婦女出現骨量的丟失，隨之血脂水平也升高[3]，并且降血脂的藥物也能明顯減緩高血脂所致的骨量丟失[4]，因此，高血脂在OP的發生與發展中起到重要作用。

積雪草酸是傘形科植物積雪草中的一種重要的五環三萜酸類化合物，化學結構如圖1，積雪草廣泛分布于我國長江流域以南的陰濕地區。傳統醫學用積雪草外用及內服治病已有兩千多年歷史，近年來，隨中藥的研究發展，人們發現積雪草酸具有廣泛的生物學活性，如抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤和促進傷口愈合等多種作用[5]。國內外已有不少關于積雪草酸在抗氧化和降血脂方面的報道[6]，并且近年來，有研究發現積雪草酸具有抑制骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化的能力[7]。因此，本研究猜測積雪草酸有可能減緩高血脂導致的骨量丟失，另外，目前在國內外還未見有關積雪草酸在防治高血脂性骨質疏松癥方面的研究報道。所以，本文通過動物實驗評價積雪草酸對高血脂大鼠骨量丟失的保護作用，初步闡明其作用機制，為進一步開發治療高血脂性骨質疏松癥的新藥提供理論依據。

圖1 積雪草酸的化學結構圖Fig.1 The chemical structure of the asiatic acid

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

積雪草酸(Asiatic acid，AA，純度≥95%，UP-LC/UV)采購于廣西昌洲天然產物開發有限公司(批號：160102)，辛伐他汀片生產于上海信誼萬象藥業股份有限公司(Simvastatin，SIM，批號：國藥準字H19980055)，普通飼料(含64%碳水化合物，10%脂肪和26%蛋白質)和高脂飼料(含28%碳水化合物，60%脂肪和12%蛋白質)采購于南通特洛菲飼料科技有限公司。低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)檢測試劑盒、I型膠原C末端肽(C-terminal telopeptides of type I collagen, CTX-I)Elisa試劑盒、I型前膠原氨基端前肽(N-terminal propeptide of type I procollagen, PINP)Elisa試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購于南京建成生物工程有限公司。

1.2 動物分組、造模及給藥

8周齡SPF級雄性C57BL/6 J小鼠60只，28.0±4.7 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養于室溫24～28℃，相對濕度為55%～65%，每天12 h照明，12 h黑暗，自由飲用自來水。所有實驗過程對動物的處置符合科技部《關于善待動物的指導性意見》要求。小鼠按體重隨機分成6組，每組10只：①空白對照組[CON, 生理鹽水：5 mL/(kg·d)]、②高脂飼料組[HFD, 生理鹽水：5 mL/(kg·d)]、③高脂飼料+低劑量積雪草酸組[HFD+AA-L：5 mg/(kg·d)]、④高脂飼料+中劑量積雪草酸組[HFD+AA-M：10 mg/(kg·d)]、⑤高脂飼料+高劑量積雪草酸組[HFD+AA-M：20 mg/(kg·d)]、⑥高脂飼料+辛伐他汀組[HFD+SIM：20 mg/(kg·d)]。

除了CON組給予小鼠普通飼料喂養，其他組別均給予小鼠高脂飼料喂養，自由攝食飼料。采用高脂飼料連續喂養16周建立小鼠骨量丟失模型[8]，并同時采用積雪草酸水溶液和辛伐他汀水溶液灌胃給藥進行干預，每2周稱量小鼠體重1次，并根據體重變化調整給藥劑量。在實驗結束前第14、13、4天和3天對全部小鼠的頸部皮下避光注射鈣黃綠素(5 mg/kg)，在小鼠骨組織中骨小梁表面形成綠色雙熒光標記，兩次熒光標記間隔時間為10 d。在熒光顯微鏡下，沉積在骨表面的鈣黃綠素呈綠色熒光。實驗進行16周后處死小鼠。收集血清、內臟及雙側脛骨和股骨。

1.3 血清中血脂指標、氧化活性指標檢測和肝腎毒性檢測

采用分光光度計檢測小鼠血清TC、TG、LDL、SOD和MDA水平，操作按說明書進行。

1.4 血清中骨轉換代謝指標檢測

用試劑盒檢測小鼠血清CTX-I和PINP水平，操作按說明書進行。

1.5 Micro-CT測量骨組織骨微結構

將左脛骨表面的肌肉剔除干凈后，于左脛骨中間處鋸斷，將脛骨上段垂直固定于特定的樣品固定器內，行Micro-CT三維掃描，掃描完成后，三維重建區域定位均在距左脛骨生長板遠端0.5 mm、層厚2 mm骨組織為松質骨感興趣區域，選取具體參數如下：X線能量70kVp，114μA；掃描模式BH：ALU；掃描分辨率0.038 mm，2048×2048，曝光時間200 ms，以最低閾值為220提取圖像信息，獲取重建圖像后，使用Micro-CT自帶的軟件進行定量分析。松質骨的定量參數包括：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)。定性3D圖包括：分段圖像(segmented image，SEG image)、分離圖(separation image，SP image)和厚度圖(thickness image，TH image)。

1.6 骨組織形態計量學檢測

分離小鼠脛骨，右脛骨用低速鋸鋸開取脛骨上段，用甲基炳烯酸甲脂包埋做不脫鈣骨切片，4 μm切片進行甲苯胺藍染色，測定成骨細胞表面百分比和破骨細胞表面百分比(Ob.S/BS和Oc.S/BS)。8 μm切片直接在顯微鏡觀察其骨組織熒光，測定骨組織動態參數，包括礦化沉積率(mineral apposition rate, MAR)、骨表面骨形成率(bone surface bone formation rate, BFR/BS)、新生骨小梁面積和骨小梁總面積比值(BFR/BV)。

1.7 股骨生物力學檢測

分離小鼠左股骨，將左股骨表面的肌肉剔除干凈后，放進裝有50%乙醇-生理鹽水的10 mL EP管里。樣本包裝好送往上海生物力學研究所進行骨生物力學檢測，檢測儀器：生物力學測試儀器QW-W600。儀器將及時記錄出每個時刻點的載荷和橈度變化值，繪制出載荷-位移曲線，然后讀取最大載荷(maximum load)、斷裂載荷(fracture load)和彈性載荷(elastic load)，并計算剛度(stiffness)。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠體重的變化

在喂養16周過程里，HFD組小鼠的體重增速高于CON組小鼠，在12～16周中，與CON組小鼠相比，HFD組小鼠的體重明顯增加(P<0.05)，而各濃度的治療組小鼠體重變化無顯著差異(P>0.05)。結果見圖2。

圖2 不同組別小鼠體重變化的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.2 Comparison of the body weight of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.2 各組小鼠血清血脂指標

HFD組小鼠血清中TC水平明顯高于CON組(P<0.05)，而TG和LDL水平差異并無統計學意義(P>0.05)。除HFD+AA-L組之外，HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠血清中TC水平比HFD組顯著降低(P<0.05)，且這三者的效果相當(P>0.05)，而各濃度治療組小鼠血清TG和LDL水平比HFD組則差異均未見統計學意義(P>0.05)。結果見圖3。

圖3 不同組別小鼠血清膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.3 Comparison of the concentrations of TC, TG, and LDL in the serum of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.3 各組小鼠血清抗氧化指標

與CON組小鼠相比，HFD組小鼠血清SOD水平明顯下降(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)。與HFD組小鼠相比，除了HFD+AA-L組小鼠之外，HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠血清SOD水平顯著升高(P<0.05)，而MDA水平顯著降低(P<0.05)。結果見圖4。

圖4 不同組別小鼠血清SOD和MDA的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.4 Comparison of the levels of SOD and MDA in the serum of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.4 各組小鼠血清骨轉換代謝指標

與CON組小鼠相比，HFD小鼠血清骨形成指標PINP水平顯著下降(P<0.05)，骨吸收指標CTX-I水平顯著升高(P<0.05)。除了HFD+AA-L組小鼠之外，HFD+AA-M、 HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠血清PINP水平均比HFD組顯著升高(P<0.05)，而血清CTX-I水平顯著降低(P<0.05)。結果見圖5。

圖5 不同組別小鼠血清PINP和CTX-I的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.5 Comparison of the levels of PINP and CTX-I in the serum of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.5 各組小鼠脛骨近端松質骨的micro-CT 3D圖

micro-CT的3D圖能說明不同組別小鼠脛骨近端松質骨的形態變化情況。

從SEG圖可見：CON組小鼠骨小梁數目多，厚度較厚，排列緊密，性狀規則；HFD組小鼠骨小梁數目減少，厚度變薄，骨微結構受損，完整的微觀構筑受到破壞；HFD+AA-L組小鼠骨微結構改善不明顯，有部分空洞；HFD+AA-M組小鼠骨小梁數目較HFD組增多，排列較均勻，骨微結構有明顯改善；HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠骨小梁數目較HFD組增多，厚度增厚，排列緊密，骨微結構有明顯改善。

從SP圖可見：CON組小鼠松質骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區域分布較少，由于骨小梁分離度顏色從藍黑色、綠色、黃色、橙色到紅色，代表分離度越來越大，CON組松質骨上段骨小梁絕大部分是藍綠色和綠色，提示CON組小鼠骨小梁分離度較低，骨小梁排列緊密。HFD組小鼠松質骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區域分布增多，特別紅色和橙色區域分布面積增加最明顯，提示HFD組小鼠骨小梁分離度增加，骨微結構存在空洞。HFD+AA-M、 HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠松質骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區域分布較少，提示其骨小梁分離度較低，排列較緊密，間隙較窄，HFD+AA-L組小鼠松質骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區域面積分布一定程度有減少趨勢，但是改善的程度并無HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組明顯。

從TH圖可見：CON組小鼠鼠松質骨上段骨小梁綠色區域分布較多，由于骨小梁厚度顏色從從藍黑色、綠色、黃色、橙色到紅色，代表厚度越來越薄，這提示CON組小鼠骨小梁厚度較大；HFD組小鼠松質骨上段骨小梁紅色和橙色區域分布多，提示HFD組小鼠骨小梁厚度變薄；與HFD組相比，除HFD+AA-L組之外，其余各組小鼠綠色和黃色區域分布均有所增加，提示其骨小梁厚度有增加，結果見圖6。

圖6 不同組別小鼠脛骨近端松質骨的micro-CT 3D圖Fig.6 3D images of micro-CT of the trabecular bone in the proximal tibia in mice among different groups

2.6 各組別小鼠脛骨近端松質骨的骨微結構參數

與CON組相比，HFD組小鼠脛骨近端松質骨骨密度(bone mineral density, BMD)、骨體積分數(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁數目(trabecular number, Tb.N)和骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)均顯著下降(P<0.05)，骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)升高(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+AA-L組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp無明顯變化(P>0.05)；HFD+AA-M組BMD、BV/TV和Tb.N均增加(P<0.05)，Tb.Sp下降(P<0.05)，但Tb.Th無明顯變化(P>0.05)；HFD+AA-H組BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加(P<0.05)，但Tb.Sp有下降趨勢，但是差異無統計學意義(P>0.05)。HFD+SIM組BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均顯著升高(P<0.05)，Tb.Sp下降(P<0.05)。結果見圖7。

圖7 不同組別小鼠血清脛骨近端松質骨的骨微結構參數的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.7 Comparison of the parameters of trabecular bone microstructure of the proximal tibias in mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.7 各組別小鼠骨組織形態學和形態計量學的變化

在熒光顯微鏡下，CON組骨組織熒光強、多且清晰，雙熒光標記的間距較寬，而HFD組的熒光標志稀少，熒光強度顯著減弱。HFD+AA-L組較HFD組熒光標志稍多，熒光強度有所增強但是不明顯；HFD+AA-M組熒光標志明顯增多，熒光強度增強；HFD+AA-H和HFD+AA-SIM組熒光標志顯著增多，雙熒光標志的間距較寬，熒光強度明顯增強。結果見圖8。

與CON組相比，HFD組的骨小梁Ob.S/BS、MAR、BFR/BS和BFR/BV均顯著下降(P<0.05)，Oc.S/BS升高(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+AA-L組Ob.S/BS、Oc.S/BS、MAR、BFR/BS和BFR/BV無明顯變化(P>0.05)；HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組Ob.S/BS、Oc.S/BS、MAR、BFR/BS和BFR/BV有明顯變化，其差異均具有統計學意義。結果見圖9。

圖8 不同組別小鼠脛骨上段熒光圖(×100)Fig.8 Fluorescence images of the proximal tibia of mice among different groups (×100)

圖9 不同組別小鼠脛骨近端松質骨的骨形態計量學參數參數的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.9 Comparison of histomorphometry parameters of trabecular bone of the proximal tibia in mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.8 各組別小鼠股骨骨生物力學檢測

與CON組相比，HFD組股骨骨生物力學maximum load、elastic load、fracture load和stiffness均顯著下降(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+AA-L組maximum load、elastic load、fracture load和stiffness均無明顯變化，其差異無統計學差異(P>0.05)。HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組maximum load、elastic load、fracture load和stiffness均顯著提高(P<0.05)。結果見圖10。

圖10 不同組別小鼠股骨骨生物力學的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.10 Comparison of the value of biomechanical indexes of the femur in mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

3 討論

高脂血癥與骨質疏松癥是我國老齡化社會的多發病和常見病，它們之間存在密切的關系。有研究發現，骨質疏松常常會伴發血脂代謝異常[9]，而治療骨質疏松的期間，血脂代謝異常往往也得以改善和逆轉[10]，當脂質代謝紊亂時又會進一步加重骨質疏松癥的發生[11]，雖然血脂代謝異常影響骨量的機制尚未清楚，但是多大數研究報道顯示，高血脂患者體內骨髓基質細胞向脂肪細胞分化增多，而導致成骨細胞分化減少，其機制可能是骨髓基質細胞的PPARy基因表達過多[12]，另外，也可能高血脂癥抑制骨髓基質細胞的骨形態發生蛋白和骨鈣素基因表達，從而使骨髓基質細胞向成骨細胞分化降低，造成骨質疏松癥[8,13]。另一方面，骨質疏松癥的發生與高脂血癥機體里抗氧化機制的失調關系十分密切，因為血脂代謝紊亂會造成機體氧化應激的發生，從而刺激破骨細胞數目增加，下調Wnt通路的相關成骨分化的基因表達來減少成骨細胞數量[14,15]，導致骨量丟失，進一步促進骨質疏松癥的發展。

本實驗結果顯示，給予高脂飼料喂養可致小鼠表現為體重增加、血清TC水平明顯升高，該研究結果與國外文獻報道具有一致[8,16]，提示高脂飼料造成小鼠出現單純性高TC血癥。大多數研究報道，高脂飲食會引起小鼠骨量丟失，尤其松質骨的丟失顯得更明顯[17,18]，本實驗的Micro-CT結果也證實了給予高脂飼料會造成小鼠的松質骨骨密度下降和骨小梁骨微結構受損，然而其相關發病機制，有研究者發現高脂飲食對小鼠的成骨細胞或破骨細胞功能具有不同的影響，其中，Cao等[18]發現給予高脂飲食后，小鼠出現骨量丟失，并且其成骨細胞和破骨細胞的分化能力均增強，同樣也有研究[19]報道，經高脂飲食后，小鼠的骨髓細胞里的成骨細胞和破骨細胞數目明顯增加。與其產生不一致的結果的是，Patsch等[20]發現給予高脂飲食喂養可導致小鼠血清骨吸收指標水平升高，骨形成指標水平無明顯變化。因此，出現以上的矛盾結果可能與不同的動物類型、不同的造模方法和時間，尤其是不同的評價成骨細胞和破骨細胞功能的方法有密切關系。本研究通過給予含有60%脂肪的高脂飼料喂養小鼠，造模時間為16周，血清結果顯示，該小鼠血清骨吸收指標CTX-I水平明顯增高，骨形成指標PINP水平明顯降低，這與骨形態計量學結果變化具有一致性，因為其破骨細胞數目增多，成骨細胞數目減少，骨形成率下降，提示了該高脂飼料造成小鼠出現高脂血癥，因此這可能導致小鼠的骨形成下降和骨吸收增強。與此同時，有研究[8]報道也出現一致的結果，高脂飼料會造成小鼠成骨細胞功能下降和破骨細胞功能活躍，其原因需要進一步探討。

有研究[8]報道，同樣采用含有60%脂肪的高脂飼料喂養小鼠，其喂養時間為8周，雖然小鼠骨密度均降低，但是其骨微結構變化與本研究的結果不一致，本研究Micro-CT結果顯示，HFD組小鼠骨微結構明顯受到破壞，這可能與喂養時間不同有密切關系，這提示長期給予高脂飼料，不但造成高脂血癥，而且會逐漸影響骨微結構。因此，本實驗結果也顯示，HFD組小鼠的骨生物力學性能明顯下降，提示高脂血癥導致骨強度下降。

積雪草酸作為常用中藥，在降血脂和抗氧化方面具有顯著效果，最近，也有研究發現積雪草酸具有抑制骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化功能。所以，從這一角度出發，本文通過觀察了不同劑量積雪草酸對血脂、骨轉換代謝、抗氧化指標、骨密度和骨微結構的影響，評價其對高脂血癥小鼠骨量丟失的保護作用。實驗結果表明，中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀可明顯下降高脂血癥小鼠TC水平，高劑量積雪草酸和辛伐他汀對小鼠高脂血癥的治療效果相當，但是低劑量積雪草酸并未發揮降血脂的作用，這說明積雪草酸在適當劑量范圍下具有明顯的降血脂能力，與給藥濃度呈一定的正相關。在高脂血癥病理狀態下，HFD組小鼠抗氧化機制受到破壞，這與Xiao等[21]的研究結果具有一致性，即是高脂血癥會造成機體抗氧化能力降低。除了低劑量的積雪草酸之外，中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀治療組的小鼠SOD水平明顯升高，MDA水平明顯下降，這提示中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀治療組抗氧化能力得到顯著改善。原因可能是中劑量和高劑量的積雪草酸具有降血脂作用，并且具有對抗脂質氧化的能力[22]，這會提升機體抗氧化的能力，從而在減緩高血脂導致骨組織受損程度，因此起到保護骨組織的重要作用。

本文的骨密度、骨微結構和骨生物力學結果顯示，中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀對高血脂導致的骨量丟失和骨結構受損有明顯的保護作用，并且提高骨強度，但是低劑量積雪草酸并未發揮該作用，這主要由于中劑量和高劑量的積雪草酸治療組能明顯促進骨形成和抑制骨吸收，因為血液骨轉換代謝指標和骨形態計量學結果可以解釋以上結論，也有可能中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀可以抑制骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化，促進其成骨細胞分化[7]，并且也與中劑量和高劑量的積雪草酸具有提升機體抗氧化的能力有密切的聯系。除低劑量積雪草酸之外，中劑量和高劑量的積雪草酸具有抗骨量丟失的作用，且高劑量積雪草酸效果稍優于中劑量，這提示積雪草酸在適當劑量范圍下能促進骨形成和抑制骨吸收，高劑量積雪草酸組未見不良反應，因此，關于積雪草酸在保護高血脂小鼠骨量丟失的最佳的藥物劑量需要進一步探討。

綜上所述，體內脂質代謝紊亂和氧化應激反應會造成或加重機體骨量丟失。本研究表明適當劑量的積雪草酸具有保護骨量丟失作用，其作用產生主要是促進骨形成和抑制骨吸收，也可能與積雪草酸能通過對抗脂質氧化來抑制機體氧化應激反應，從而抑制破骨細胞的生長和成骨細胞分化，緩解骨量丟失。另外，也可能與積雪草酸降低血脂，從而抑制骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化，促進其成骨細胞分化，防止骨量丟失。