Wnt/β-catenin、RANKL/LGR4通路因子在骨質疏松性骨折端的表達

曹燕明 王斌 金晶 鄭聰 黎明明 魏嘯 胡海瀾 凌龍

廣州醫科大學附屬第二醫院骨科二區，廣東 廣州 510260

隨著人口老齡化的增加，骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)的發病率逐年升高。據統計，我國65歲以上的老年人在無意識跌倒時，有87%會發生OPF，與對照組相比，OPF愈合時間遲緩，骨折固定難度增加，骨不連及再骨折發生率較高[1]。因此，研究OPF的發病、愈合因素，已經成為臨床的迫切需要。成骨和破骨成為防治骨質疏松癥的熱點。Wnt/β-catenin通路中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc是關鍵的成骨因子[2,3]。RANKL/LGR4通路中LGR4、RANKL是調控破骨分化的關鍵因子[4]。本研究擬采用RT-PCR、Western blotting技術檢測比較OPF組與對照組患者骨折端骨組織LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、RANKL、LGR4的表達差異，探討OPF的發病機制及影響因素。

1 材料和方法

1.1 研究對象及受試基本條件

本研究選擇2016年1月至2017年7月在廣州醫科大學附屬第二醫院骨科就診的股骨骨折患者56例，對照組患者29例；OPF組患者27例。患者傷前具備正常活動能力及完全民事行為能力，無精神及認知障礙，X線等影像學確診為骨折，需要切開或有限切開復位內固定或關節置換術，同意為本研究受試。并簽署知情同意書告知研究涉及的相關事宜。

1.2 入組標準

1.2.1OPF組入組標準：①滿足受試基本條件。②雙能X線骨密度儀(DXA)測量，T值≤-2.5，診斷為骨質疏松癥；③受傷過程滿足脆性骨折定義，即低能量或者非暴力骨折。

1.2.2對照組入組標準：①滿足受試基本條件。②雙能X線骨密度儀(DXA)測量，T≥-1.0；

1.2.3排除標準：①伴發有嚴重慢性疾病：如中、重度慢性阻塞性肺疾病、心力衰竭、腦梗死等。②患有各種可致繼發性骨質疏松的內分泌性疾病；患有影響鈣和維生素D吸收和調節的疾病，如患有消化道、腎臟疾病、骨髓瘤或其他惡性疾病。③1年內長期接受雙膦酸鹽類、雌激素、PTH等抗骨質疏松藥物或者激素治療的患者。④因病情需要，術式不暴露骨折端的或難以取骨的患者。

1.3 骨組織標本收集

患者在傷后3～7 d內根據骨折類型分別行髖關節置換術(25例)、有限切開骨折復位髓內釘內固定術(24例)、切開復位鋼板內固定術(7例)。術中于骨折斷面內用刮匙刮取骨折處骨組織≥200 mg，迅速放入小液氮瓶中。

1.4 實驗主要儀器及試劑

1.4.1儀器：紫外分光光度計：Nano Drop Technologies，USA；PCR 儀、CLINX凝膠成像儀、垂直電泳儀、熒光定量PCR儀：美國伯樂公司。

1.4.2試劑：RNAiso Plus、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PrimeScript RT Master Mix：Taraka公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：上海碧云天公司；Tublin Beta Polyclonal Antibody：四正柏生物公司；LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、LGR4、RANKL一抗抗體：Abcam公司；GAPDH內參、二抗Peroxidase-conjugated Goat Anti-Mouse leggy、Goat Anti-Rabbit(H+L)Pyroxenitic、Rabbit anti-Goat IgG-HRP：愛必信(上海)生物科技有限公司。

1.5 RT-PCR過程：

1.5.1RNAiso Plus法提取骨組織內總RNA、定量：取骨樣品100 mg，加液氮研磨，勻漿，室溫靜置5 min。4℃下12,000 g離心5 min。加入氯仿0.2 mL。振蕩15 s，15到30 ℃孵育5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min。將水相上層移至無RNA酶離心管中。加等體積異丙醇，混勻后15～30 ℃孵育10 min后，于4 ℃下12 000 r/m離心10 min。移去上清液，加入1 mL的75%乙醇。混勻，4 ℃下7,500×g 離心5 min后棄去上清，室溫干燥5～10 min。加入無RNA酶的水40 μL，獲得RNA溶液。用DEPC水做空白標記，光度計檢測讀取OD比值介于1.8～2.0之間。

1.5.2逆轉錄、RT-PCR：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，1×Total RNA 1μg，RNase Free dd H2O up to 10 μL。輕柔混勻后進行反轉錄反應，條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，4 ℃ 持續。用Primer Premier 5.0軟件設計、賽默飛公司合成的引物(序列見表1)，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL, PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)7.5 μL，RT反應液(cDNA溶液)2 μL，滅菌蒸餾水4.5 μL，Total 15 μL。預變性Repeat：95 ℃，30 s，PCR反應 Repeat：40，95 ℃，5s，60 ℃，30～60 s。選擇GAPDH做基因相對表達分析的內參基因，結果使用QPCR儀自帶Rotor-Gene Q Software進行計算所有樣品的Ct值，采用2-ΔΔCT表示OPF組目的基因相對對照組樣本表達變化的倍數。

1.6 Western Blotting分析

1.6.1骨組織總蛋白的提取、濃度測定：在液氮保護下錘擊加研磨液氮中取出的骨組織100 mg，加入裂解液(骨組織/裂解液為1 mg/10 μL，蛋白裂解液：蛋白酶抑制劑為100∶1)，冰上裂解30 min，4℃12,000 r/min，離心30 min。吸取中間層，按照BCA蛋白標準液的方法配制工作液，96空板內操作上樣，檢測吸光度，后繪制標準曲線，算出樣品蛋白的濃度。

1.6.2電泳、轉膜、顯影：根據分子量及相對內參配置不同濃度的膠(LRP5、Runx2、C-myc選擇10%濃度的膠，內參為GAPDH；β-catenin、LGR4選擇6%濃度的膠，內參為Tublin；RANKL選擇10%濃度的膠，內參為Tublin)。蛋白加上樣緩沖液(5×)，98 ℃加熱10 min，然后根據濃度各孔加入上樣量及蛋白Marker。電泳60 V 30 min，105V1.5 h。轉膜105 V 1.5 h。脫脂奶粉搖床封閉孵育1 h。然后把封閉過后的NC膜至于脫色搖床上一抗(根據Abcam試劑說明書的比例)4 ℃過夜14～16 h，取出膜用tbst溶液洗滌，后室溫把膜至于脫色搖床上二抗(根據對應抗體)孵育1 h，后取出膜用tbst溶液洗滌。將膜置于CLINX凝膠成像儀中發光顯影。

1.7 統計學處理

表1 引物序列表Table 1 List of the primer sequences

2 結果

2.1 患者一般資料

患者一般資料見表2。

表2 對照組和OPF組內一般資料比較Table 2 Comparison of general data between control group and OPF group

從表2可以看出本次納入研究的對照組患者以男性居多，OPF組患者以女性居多，符合該類疾病臨床發病率規律。年齡、身高、體重P值>0.05，兩組之間無差異性。對照組骨密度正常，OPF組骨密度T值<-2.5。

2.2 各組患者骨組織各因子檢測表達比較

RT-PCR檢測OPF組對比對照組患者LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、LGR4表達降低(P<0.05)，RANKL表達升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 對照組和OPF組患者mRNA表達情況Fig.1 mRNA expression of patients in control group and OPF group

Western blotting檢測OPF組對比對照組患者LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、LGR4表達降低(P<0.05)，RANKL表達升高(P<0.05)(圖2、3)。

圖2 對照組和OPF組目的基因蛋白的表達圖Fig.2 Expression of genes and proteins in control group and OPF group

圖3 對照組和OPF組目的基因蛋白的定量表達(Image J軟件定量對比灰度)Fig.3 Quantitative expression of genes and proteins in control group and OPF group (ImageJ software quantitative contrast grayscale)

3 討論

骨質疏松癥(osteoporosis)是一種全身性的骨骼老化或廢用退化相關的代謝障礙性疾病，以骨量減少、結構退化、脆性增加，易發生骨折為特征[5]。股骨頸OPF約占全身骨折的3.58%，骨質疏松并發骨折致殘率高，嚴重影響患者的生活質量。骨質疏松癥病因包括內分泌、遺傳、營養、廢用、藥物等各方面，直接原因是骨吸收和骨形成平衡機制打破，破骨細胞的骨吸收作用大于成骨細胞的骨形成作用，引起骨質疏松癥并易發骨折[6]。在調控骨重建的信號轉導通路中主要包括調控成骨細胞的Wnt/β-Catenin信號通路和破骨細胞的RANKL/LGR4信號通路等[7]。

Wnt/β-cateinin信號通路與間充質干細胞、成骨細胞、軟骨細胞關系密切[7-12]。典型通路包括Wnt家族分泌蛋白配體、卷曲受體(Frizzled)和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)復合物、蓬亂蛋白(Dvl)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、直腸腺瘤性息肉蛋白(APC)、β-連環蛋白(β-catenin)等胞內蛋白，以及核內轉錄因子(Tcf)等一系列蛋白。如果Wnt信號關閉的情況下，游離的β-catenin與GSK-3β結合后磷酸化，隨后降解，此時的胞質中的β-catenin水平較低[2]；如果Wnt信號通路被激活，Wnt與LRP5/6、Frizzled相互結合形成復合體，招募Dvl和降解復合物(由軸蛋白、APC、GSK-3β等組成)，抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化。未磷酸化的β-catenin逐漸積累，到一定的量就會進入細胞核和TCF/LEF轉錄因子相結合，激活下游靶基因并轉錄表達，如核心結合因子(Runx2)，原癌基因(C-myc)等[3]。

β-catenin是Wnt/β-catenin通路中最關鍵的成骨因子。Hill等[10]在小鼠的骨髓間充質干細胞中敲除β-catenin基因，發現小鼠的軟骨生成增加而成骨細胞生成減少，揭示了β-catenin對早期間充質細胞向成骨細胞定向分化是必需的。本實驗OPF組內β-catenin表達下降，表明OPF組內的Wnt/β-catenin通路處于抑制的狀態，這種狀態可能與OPF后成骨不足有關。Runx2是骨形成過程中最早和最具特異性的標志基因，是決定骨脆性的重要因素[13]。Runx2能上調成骨細胞和軟骨細胞的共同前體細胞中各種礦化相關蛋白基因的轉錄，對軟骨內成骨和膜內成骨均有幫助[14]。Komori等[15]研究發現Runx2基因敲除的小鼠成骨分化即被阻斷。本實驗OPF組表達Runx2降低，說明Runx2的表達下調可能是影響OPF的因素。LRP5存在多種細胞膜表面[16]。van Meurs 等[17]研究發現LRP5的Met667和Val1330等位基因與腰椎、股骨頸的骨密度下降有關。Zhou等[18]對絕經后骨質疏松癥患者的LRP5基因多態性與唑來膦酸反應相關性進行研究分析，發現CC和CT基因型患者的骨密度、血清β-CTX和ALP顯著下降。本實驗發現OPF組LPR5的表達明顯減少，考慮骨硬化蛋白可能通過與LRP5/6的高度結合，使Wnt/β-catenin通路處于抑制狀態，導致骨形成受阻[19,20]，另外可能同時存在OPF后LRP5受體減少的情況。C-myc是Wnt/β-catenin通路下游的重要靶基因。C-myc的蛋白促進細胞周期從G1加速進入S期，促進成骨細胞分化增殖和分化，胞漿β-catenin的水平決定了與核內C-myc的表達能否被激活[21]。本實驗檢測發現C-myc在OPF后表達下降，說明C-myc作為Wnt/β-catenin下游靶標基因，可進一步從核內轉錄水平表明OPF組內的Wnt/β-catenin通路處于抑制的狀態或成骨不足。

在RANKL/LGR4信號通路中，核因子κ B受體活化因子配體(RANKL)是目前研究發現僅有的具有刺激破骨細胞分化、成熟和阻止破骨細胞凋亡的因子[22-24]，G蛋白偶聯受體48(GPR48，又稱LGR4)是RANKL的一個重要受體，在破骨細胞分化過程中LGR4與RANK競爭結合RANKL，激活了Gαq和GSK3-β信號通路，抑制了破骨細胞生成過程中活化T細胞核因子的表達和活性，抑制了RANKL/RANK信號的破骨細胞分化和骨吸收[4]。

本實驗發現，OPF患者骨組織內RANKL表達上升，說明RANKL促進破骨細胞分化增強引起骨質疏松。因而阻斷RANKL/RANK信號通路在OPF骨破壞中的作用，有重要的臨床意義，有研究對OPF患者用唑來膦酸鈉注射，30 d內RANKL的水平呈現出下降的趨勢[25],這也與本實驗結果相符。敲除LGR4的小鼠顯示破骨細胞過度活化和骨質破壞增加[26]；也有研究[27]認為LGR4基因無突變情況下引起人類的骨礦物質密度(BMD)降低，其分子機制尚不清楚。實驗發現LGR4在OPF組中表達下降，可能是LGR4抑制破骨和骨質減少，可能是抑制了RANK信號。而RANKL在OPF組內表達上升，這結果符合LGR4與RANK競爭結合RANKL，抑制了RANKL/RANK信號破骨的作用。既然LGR4是RANKL的受體，負向調控了破骨細胞分化和骨吸收，故LGR4可用于治療骨質疏松癥和其他骨質破壞疾病[7]。有研究[4]在骨質疏松癥小鼠模型中LGR4胞外域(ECD)可以治療RANKL誘導的骨量丟失。而Denosumab是RANKL的一個抗體，有許多副作用，如鈣穩態失衡和低鈣血癥[28,29]。有研究LGR4-ECD蛋白比骨保護素與RANKL結合親和力較低，對破骨細胞分化正常小鼠的生理負影響小，這表明LGR4能拮抗RANKL的副作用，以LGR4為靶標的抑制劑影響成熟的破骨細胞[4]治療骨質疏松癥具有較大的優勢。

本研究發現OPF與Wnt/β-catenin成骨信號通路中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc因子成骨抑制或減弱有關，與RANKL/LGR4破骨信號通路中RANKL因子破骨增強、LGR4因子破骨抑制有關。藥物或其他治療可提高或限制這些相互作用的發展。對于骨質疏松的患者，通過干預這些基因水平的變化，可以降低OPF發生的幾率，促進其骨折愈合，從而降低其并發癥的發生。