去卵巢對大鼠頜骨成骨細胞增殖與成骨分化能力的影響

許雄程 陽雪 何夢嬌 吳玉銘 李艷芬 陳玉玲 駱凱*

1. 福建醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，福建 福州 350002

2. 福建省高校口腔醫(yī)學重點實驗室，福建 福州 350002

3. 福建醫(yī)科大學口腔醫(yī)學研究院，福建 福州 350002

更年期婦女易出現絕經后骨質疏松(Postmenopausal osteoporosis, PMO)，PMO可導致患者的骨量減少，增加出現骨折的風險[1]。雌激素水平降低導致骨改建過程中骨吸收大于骨形成是PMO的主要病因。作為參與骨形成的主要細胞，成骨細胞的增殖及成骨分化能力與骨生成密切相關[2]。同時，成骨細胞還可通過分泌核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand, RANKL)、骨保護素和基質金屬蛋白酶等細胞因子等參與破骨細胞功能的調控，影響骨吸收[3]。近年來，已有研究通過體外分離培養(yǎng)PMO成骨細胞探討去卵巢所致低水平雌激素對成骨細胞的影響，但這些研究多以股骨等長骨來源的成骨細胞為研究對象[3-5]。與長骨等骨組織不同，頜骨的發(fā)育來源于神經嵴外胚層，頜骨對去卵巢引起的骨喪失的敏感性也不同于長骨等中胚層來源的骨組織[6, 7]。有關去卵巢對頜骨成骨細胞生物學行為影響的研究目前尚鮮見報道。因此，本實驗擬通過分離培養(yǎng)去卵巢骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞，探討去卵巢對頜骨成骨細胞增殖與成骨分化能力的影響，以期為探討頜面部骨組織骨質疏松的發(fā)病機制與防治提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

3月齡同批次SPF級健康雌性未孕Sprague-Dawley(SD)大鼠20只，體重250 g～300 g(由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院提供)，隨機分為實驗組與對照組。實驗設計與實驗過程嚴格遵照福建醫(yī)科大學動物倫理委員會準則。

1.2 實驗試劑及儀器

DMEM低糖培養(yǎng)液、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國)；膠原酶、茜素紅S、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松(Sigma，美國)；鏈霉素、青霉素、CCK-8(Cell Counting Kit-8)、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara，日本)；兔抗大鼠Runx2(Runt-related transcription factor 2)單克隆抗體、兔抗大鼠骨鈣素(Osteocalcin, OC)單克隆抗體(Abcam，美國)；引物合成(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體、HRP-羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。

HEAL FORCE 超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；冷凍高速離心機(Heraeus，德國)；生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)；細胞培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)；倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，日本)；實時熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480，德國)；iMARK酶標儀(Bio-Rad，美國)；電泳、電轉移裝置(Bio-Rad，美國)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1去卵巢骨質疏松大鼠模型的建立：20只SD大鼠經腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉，實驗組和對照組各10只。參考課題組前期方法[8]，實驗組無菌操作下完整摘除雙側卵巢，為去卵巢組(Ovariectomy, OVX)；對照組為無菌操作下摘除卵巢附近同等體積的脂肪組織，為假手術組(Sham-operated, Sham)。術后定量喂食，自由飲水。

1.3.2大鼠成骨細胞分離培養(yǎng)：術后12周經腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉處死大鼠，參照已有方法[9]，無菌操作下取大鼠下頜骨去除肌肉軟組織、骨膜、骨髓、松質骨等，留取皮質骨，用PBS清洗后剪成1 mm～2mm大小。以0.25%胰蛋白酶37 ℃孵育10分鐘，DMEM培養(yǎng)液沖洗。經0.1%膠原酶消化30分鐘后，棄上清液。再消化1小時后，收集上清液。經1500g離心后去除上清液，加入含10%%FBS、鏈霉素100U/mL和青霉素100U/mL的DMEM低糖培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d更換培養(yǎng)液直至細胞達90%融合，以0.25%胰酶+0.1%EDTA消化傳代。實驗選擇3代以內的細胞進行。

1.3.3CCK-8增殖實驗：取對數生長期的OVX組與Sham組頜骨成骨細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，分別于第4d、7d采用CCK-8檢測細胞的增殖能力。即取兩組細胞各6孔，根據CCK-8試劑盒操作說明，每孔加入200 μL新鮮配制CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后吸棄孔內培養(yǎng)液，酶標儀檢測各孔450 nm 處的光密度值(Optical density, OD)。

1.3.4堿性磷酸酶染色：分別將OVX組與Sham組頜骨成骨細胞以2×104個/孔的密度接種于24孔板， 1d后更換為骨誘導液(含50 mg/mL 抗壞血酸、2mmol/L β-甘油磷酸鈉和10 nmol/L地塞米松的完全培養(yǎng)液)[9]。培養(yǎng)7 d后用95%乙醇固定15 min，根據試劑盒操作說明進行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色。

1.3.5堿性磷酸酶活性：取生長良好的OVX組與Sham組頜骨成骨細胞，按2×104個/孔接種于24孔板，于成骨誘導后第4d、7d棄去原培養(yǎng)液，經PBS洗3次后，加入200 μL RIPA裂解液對細胞進行裂解，取50 μL的細胞裂解液至另一96孔板，PBS 液空白調零。按ALP檢測試劑盒操作說明，加顯色劑，37 ℃孵箱孵育30 min，酶標儀檢測各孔405 nm處的OD值。取同一孔細胞裂解上清液，參考細胞總蛋白試劑盒說明書測定樣本中的總蛋白濃度。結果用細胞總蛋白標準化。

1.3.6茜素紅染色：將OVX組與Sham組頜骨成骨細胞按每孔2×104個的密度接種于24孔板，待細胞生長至60%～70%融合時，更換為成骨誘導液。每3天換液，于成骨誘導第14 d棄去原培養(yǎng)液，PBS 洗3次，95%乙醇室溫固定15 min。PBS洗3次，1%茜素紅染液染色10 min，蒸餾水洗 3 次。以10 mmol/L磷酸鈉溶解的10%氯化十六烷基氨基吡啶洗脫10 min，酶標儀測570 nm處的OD值。

1.3.7實時熒光定量PCR：分別將生長狀態(tài)良好的OVX組與Sham組大鼠頜骨成骨細胞以1×105/孔接種于6孔板，成骨誘導4 d和7d后吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，采用Trizol提取細胞的總RNA，經逆轉錄合成cDNA。按照試劑盒說明書操作，采用實時熒光定量PCR檢測兩組細胞ALP、Runx2和OC的表達，以GAPDH為內參，實驗重復3次。GAPDH上游引物為：CGGCAAGTTCAACGGC ACAGTCAAGG，下游引物為：ACGACATACTCAGC ACCAGCATCACC；ALP上游引物為: ACAAGGTGGT GGACGGTGAAC，下游引物為：CGTGAAGCAG GTGAGCCATAGG；RUNX2上游引物為：TCTGACTG GAAGAGCGGAGAG，下游引物為：GAGTGGGGAA CACACAGGTCT；OC上游引物為：TCCCAGTAT GAGAGTAGGTGTCC，下游引物為：GGCTCAGATA AGAGGGGTAAGAC。

1.3.8Western blot：通過Western blot實驗檢測兩組細胞Runx2和OC的表達。即分別將生長狀態(tài)良好的OVX組與Sham組頜骨成骨細胞以1×105/孔接種于6孔板。成骨誘導7 d后，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗3次，裂解收集細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉膜。一抗孵育，GAPDH(1∶1000)、Runx2(1∶1000)、OC(1∶500)；TBST洗膜，二抗孵育(1∶1000)。化學發(fā)光顯色后以Image J軟件分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計

實驗數據用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學處理，結果以均數±標準差表示，采用兩樣本t檢驗分析，P<0.05為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 頜骨成骨細胞原代培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

大鼠骨組織消化液接種至培養(yǎng)瓶，24 h后在倒置相差顯微鏡下觀察，可見成骨細胞散在貼附于培養(yǎng)瓶底，呈梭形或三角形。3 d后，貼壁細胞增多，細胞形態(tài)多樣，并向外伸展出生長突。7 d后，貼壁細胞向周圍呈鱗片樣生長，局部匯合成單層(圖1)。12 d左右，貼壁細胞可達90%融合。OVX組與Sham組細胞形態(tài)未見顯著差異。

圖1 大鼠頜骨成骨細胞原代培養(yǎng)a.Sham組成骨細胞； b.OVX組成骨細胞；標尺200 μmFig.1 The morphological appearance of osteoblasts from rat mandibles. (a) Sham group osteoblasts; (b) OVX group osteoblasts. Bar 200 μm

2.2 去卵巢對頜骨成骨細胞增殖能力的影響

采用CCK8法對比OVX組與Sham組頜骨成骨細胞的增殖能力。在細胞接種后4 d、7d，OVX組成骨細胞OD值均顯著高于Sham 組成骨細胞(圖1)，表明去卵巢后頜骨成骨細胞的增殖能力增強。

圖2 去卵巢對大鼠頜骨成骨細胞增殖的影響*P<0.05,**P<0.01Fig.2 The effect of ovariectomy on proliferation of osteoblasts from rat mandibles.*P<0.05,**P<0.01

2.3 去卵巢對頜骨成骨細胞ALP活性的影響

OVX組與Sham組大鼠頜骨成骨細胞在成骨誘導后7 d后行ALP染色，兩組細胞均可著色，OVX組成骨細胞著色更深(圖3 a-b)。成骨誘導4 d、7d后，OVX組ALP活性均顯著高于Sham組(圖3c)，與ALP染色結果一致。結果提示去卵巢后頜骨成骨細胞ALP的表達增強。

圖3 去卵巢對大鼠頜骨成骨細胞ALP的影響a.Sham組頜骨成骨細胞ALP染色； b.OVX組頜骨成骨細胞ALP染色； c.ALP活性；標尺200 μm，*P<0.05,**P<0.01Fig.3 The effect of ovariectomy on ALP expression of osteoblasts from rat mandibles. (a) ALP staining of Sham group; (b) ALP staining of OVX group; (c) ALP activity. Bars 200 μm,*P<0.05,**P<0.01

2.4 去卵巢對頜骨成骨細胞礦化結節(jié)形成能力的影響

成骨誘導14 d后，OVX組與Sham組大鼠頜骨成骨細胞均可形成礦化結節(jié)，但OVX組的形成量顯著少于Sham組(圖4 a-b)。定量分析顯示，OVX組礦化結節(jié)量顯著少于Sham組(圖4c)。結果提示去卵巢可下調頜骨成骨細胞形成礦化結節(jié)的能力。

圖4 去卵巢對大鼠頜骨成骨細胞礦化結節(jié)形成能力的影響a.Sham組茜素紅染色； b.OVX組茜素紅染色； c.茜素紅染色定量分析；標尺200 μm，*P<0.05,**P<0.01Fig.4 The effect of ovariectomy on Alizarin red S staining of osteoblasts from rat mandibles. (a) Alizarin red S staining of Sham group; (b) Alizarin red S staining of OVX group; (c) Quantification of Alizarin red S staining. Bars 200 μm.*P<0.05

2.5 去卵巢對頜骨成骨細胞成骨相關基因表達的影響

熒光定量PCR檢測結果顯示成骨誘導4 d、7d后，OVX組頜骨成骨細胞ALP表達水平顯著高于Sham組，與ALP活性檢測結果相一致；而Runx2與OC的表達水平均顯著低于Sham組(圖5 a-c)。結果表明去卵巢可影響頜骨成骨細胞成骨相關基因的表達。

2.6 去卵巢對頜骨成骨細胞成骨相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，成骨誘導7 d后，OVX組頜骨成骨細胞Runx2與OC的表達水平均顯著低于Sham組(圖6)，與基因表達水平相一致。表明去卵巢可影響頜骨成骨細胞成骨相關蛋白的表達。

3 討論

頜骨在發(fā)育起源、骨化方式和骨基質成分等方面均不同于長骨，與長骨存在位點特異性差異[10]。研究發(fā)現頜骨來源的成骨細胞在增殖與成骨分化能力方面均不同于長骨來源的成骨細胞[11-12]。同時，頜骨的骨代謝也與長骨不同，對體內雌激素水平的變化也表現出位點特異性。Liu和Du等[6-7]通過microCT檢測對比大鼠卵巢切除后不同時間點的頜骨與長骨骨量的變化，發(fā)現頜骨出現顯著骨量下降的時間要晚于長骨。當前有關去卵巢所致低水平雌激素對頜骨成骨細胞影響還不明確。因此，本研究通過切除大鼠卵巢建立骨質疏松模型，在此基礎上體外分離培養(yǎng)頜骨成骨細胞，探討去卵巢對頜骨成骨細胞增殖與成骨分化能力的影響。研究結果顯示去卵巢大鼠頜骨成骨細胞與假手術組相比，細胞的增殖能力以及ALP的表達增加，但體外礦化結節(jié)形成能力、Runx2及OC的表達降低。

圖5 去卵巢對頜骨成骨細胞成骨相關基因表達的影響*P<0.05,**P<0.01Fig.5 The effect of ovariectomy on osteogenesis-related gene expression of osteoblasts from rat mandibles.*P<0.05,**P<0.01

圖6 去卵巢對頜骨成骨細胞成骨相關蛋白表達的影響*P<0.05Fig.6 The effect of ovariectomy on osteogenesis-related protein expression of osteoblasts from rat mandibles.*P<0.05

ALP作為非特異性磷酸單酯酶，是早期成骨分化的標志物。成骨細胞可通過表達ALP分解磷酸化合物，形成磷酸鹽離子，進而與鈣離子結合形成羥基磷灰石，沉積于骨組織[13]。本實驗結果顯示，卵巢切除大鼠頜骨成骨細胞ALP表達上調。這一結果與Yu和Tro?t等[5, 14]的研究結果一致。Yu等[14]通過體外分離培養(yǎng)卵巢切除術后4周和8周的大鼠頜骨成骨細胞，發(fā)現卵巢切除大鼠隨著雌激素水平的降低，大鼠頜骨成骨細胞的的ALP活性均相應上調。Tro?t等[5]通過基因芯片檢測PMO患者股骨頸成骨細胞基因組mRNA的表達，研究結果顯示PMO狀態(tài)下成骨細胞ALP的mRNA表達上調。上述結果及我們的實驗結果提示低水平雌激素狀態(tài)下，頜骨成骨細胞ALP的表達升高。我們推測這可能是由于PMO狀態(tài)下頜骨成骨細胞處于高骨代謝水平以代償增高的破骨細胞活性。

Runx2作為成骨細胞的主要轉錄因子之一，是成骨分化調控網絡的上游分子，可啟動下游OC、I型膠原和骨橋蛋白等的表達以促進成骨分化，從而促進細胞外基質沉積，形成骨組織[15]。本實驗采用熒光定量PCR和Western blot分別從mRNA與蛋白水平對OVX組大鼠頜骨成骨細胞Runx2與OC的表達進行檢測，結果發(fā)現PMO狀態(tài)下頜骨成骨細胞Runx2與OC的表達均顯著下調，該結果提示去卵巢大鼠頜骨成骨細胞的成骨能力處于異常狀態(tài)，細胞的成骨分化能力下降。Tro?t等的研究發(fā)現骨質疏松患者的股骨頸成骨細胞Runx2的表達下調，而OC的表達無顯著差異[5]。這可能與其所研究的對象為長骨來源的成骨細胞有關。

礦化結節(jié)的形成是成骨細胞分化成熟的標志。茜素紅可與胞外基質蛋白礦化形成的鈣結節(jié)結合而發(fā)生顯色反應，因而常用于檢測細胞的礦化結節(jié)形成能力。本實驗采用茜素紅染色與定量分析探討PMO大鼠頜骨成骨細胞體外礦化節(jié)結形成的能力。結果發(fā)現，與對照組相比PMO大鼠頜骨成骨細胞體外礦化結節(jié)的形成能力顯著下降。結合熒光定量PCR和Western blot的檢測結果及文獻報道[5-12]，我們推測盡管去卵巢導致頜骨成骨細胞增殖能力與ALP活性增高，但低表達的Runx2與OC可能最終使得其骨基質沉積能力降低，Runx2介導的信號通路在頜骨骨質疏松發(fā)生過程中可能扮演重要的角色，該假設尚需進一步的研究證實。此外，本實驗僅初步探討了體外培養(yǎng)的骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的增殖及成骨分化能力，對細胞在體內的成骨分化能力還有待探討。我們將在后續(xù)研究中進一步分析骨質疏松狀態(tài)下頜骨成骨細胞的生物學行為及其調控機制，以期為口腔頜面部骨質疏松的發(fā)病機理與防治提供實驗依據。