12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠絕經后骨質疏松模型的合適時機

傅光濤 劉生 李長川 伍俊妍 李仕勛 秦嶺 劉偉 邱俊雄 彭芃 丁悅,5*

1. 中山大學孫逸仙紀念醫院骨外科，廣東 廣州 510120

2. 中山大學孫逸仙紀念醫院核醫學科，廣東 廣州 510120

3. 中山大學孫逸仙紀念醫院藥學部，廣東，廣州 510120

4. 香港中文大學醫學院骨科&肌肉骨骼研究實驗室 香港

5. 中山大學孫逸仙紀念醫院廣東省惡性腫瘤表觀遺傳學與基因調控重點實驗室，廣東 廣州 510120

骨質疏松癥是一種以骨量降低、骨脆性增加、骨強度下降、骨折風險性增大為特征的全身性、代謝性骨病。骨質疏松癥是中國60歲以上人口面臨的主要健康殺手之一，預計到2020年，將有超過2億中國人受骨質疏松癥和骨量減少的影響[1]。骨質疏松癥及其并發癥顯著增加了患者的致殘率及死亡率，嚴重影響患者的生活質量[2]。因此，明確骨質疏松癥的確切發病機制，研制有效的預防及治療骨質疏松癥的方法具有重要的臨床意義。骨質疏松癥動物模型作為基礎研究的重要媒介，在上述研究過程中起著十分重要的作用。卵巢切除法由于其建模因素單一，建模成功率高，可重復性好，可信度大，且能夠很好地體現雌激素水平下降等優點，已成為應用最廣泛的絕經后骨質疏松癥動物模型的建模方法[3]。目前，卵巢切除術誘導的雌性SD大鼠骨質疏松模型的技術已非常成熟，并在骨質疏松領域的研究中得到廣泛應用[4]。美國食品藥物管理局也建議選擇切除6～9個月齡的雌性SD大鼠的雙側卵巢來構建絕經后骨質疏松癥動物模型[5]。但是大鼠作為整體模型具有成本高、周期長、用藥量大等缺點，并不能完全滿足研究者對建模動物的要求。C57/BL6J小鼠因其遺傳背景清晰，易于繁殖且耐受性強，是目前基礎研究中應用最為廣泛的小鼠種屬之一[6]。由于其生理周期及卵巢切除后的骨量變化趨勢與大鼠相似，骨丟失同樣可被雌激素替代療法所預防，C57/BL6J小鼠目前也越來越多地應用于骨質疏松及骨量基因控制領域的研究中[4,7,8]。但與建模技術成熟、應用最為廣泛的大鼠相比，卵巢切除術誘導的小鼠絕經后骨質疏松模型的建模周齡及建模所需時間目前尚無統一的標準。研究者采用的雌性小鼠建模周齡的跨度較大(6～24周)，造模時間更是參差不齊(1～12周)[7-14]。

本研究使用雙能X線骨密度儀(dual energy X-ray absorptiometry, DEXA)及micro-CT測量不同周齡的C57/BL6J雌性小鼠在卵巢切除術后不同時間點的全身、脊柱及下肢骨密度(bone mineral density, BMD)，脛骨近端骨微結構及相關參數變化，探討卵巢切除術誘導的C57/BL6J雌性小鼠絕經后骨質疏松模型的合適建模周齡及建模所需的時間。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

本研究使用的60只SPF級成年C57/BL6J雌性小鼠均于中山大學東校區實驗動物中心購置。本研究已取得中山大學動物實驗倫理批件(倫理審批號：IACUC-DB-16-0308)，所有實驗流程均嚴格遵守實驗室動物護理和使用指南。實驗前，所有小鼠均于中山大學北校區實驗動物中心內飼養1周以上以適應環境。每個籠子飼養6只小鼠，不限水的攝入量，并給與標準飲食。室溫維持于22°C，濕度為60%～75%，每日光照時間為12 h。

1.2 實驗分組

60只C57/BL6J雌性小鼠隨機平均分為8周去勢組(n=30)及12周去勢組(n=30)。8周去勢組小鼠于8周，12周去勢組小鼠于12周分別進行雙側卵巢切除術，兩組小鼠均于手術當天，術后6周、8周、10周及12周各隨機抽取6只小鼠進行全身、脊柱及下肢的BMD測量及脛骨近端的micro-CT測量。

1.3 雙側卵巢切除術

使用戊巴比妥鈉(1%，50 mg/kg，腹腔注射)麻醉成功后，俯臥位固定小鼠。背部備皮，切口區域使用75%酒精擦拭消毒3次。于肋下1 cm水平作一長約1 cm的縱行切口，切開筋膜，鈍性分離肌肉及腹膜，在腸系膜脂肪中找到呈紅色的，大小約3～4 mm的卵巢，在子宮角上用絲線結扎輸卵管，完整切斷輸卵管及卵巢[15]。使用同樣的方法進行切除對側卵巢及輸卵管。使用可吸收線依次縫合肌肉及皮膚。術后將切除的組織行HE染色以確定為卵巢組織。實驗期間所有小鼠均未出現傷口感染及死亡。

1.4 BMD測量

小鼠使用戊巴比妥鈉(1%，50 mg/kg，腹腔注射)麻醉成功后，固定于俯臥位。根據既往研究所描述的流程[16]，使用DEXA(LUNAR DPXMD#5966, Madison, WI, USA)及系統自帶的小動物骨密度分析軟件測定小鼠的全身、脊柱及下肢的BMD(g/cm2)。

1.5 micro-CT測定

所有小鼠均在測量BMD結束后予過量麻醉藥法處死。將剔除周圍軟組織的脛骨標本置于10%福爾馬林中固定24 h后進行micro-CT掃描 (SkyScan 1176; SkyScan, Kontich, Belgium)。掃描條件如下：源電壓45 kV、源電流500 μA、曝光時間240 ms，分辨率18 μ m，濾片選擇0.2 mm厚度的鋁片。使用micro-CT自帶的三維重建軟件(NRecon, Skyscan, Kontich, Belgium)對所有掃描圖片進行3D重建，并使用系統分析軟件(CTAn, Skyscan, Kontich, Belgium)計算距離脛骨近端骺板1 mm～2mm區域(共60張圖片)的松質骨的骨體積分數 (BV/TV,%)，骨小梁數量(Tb. N, 1/nm)及骨小梁分離度 (Tb. Sp, μm)。所有測量及分析流程均嚴格遵守美國骨礦鹽研究學會推薦的骨微結構micro-CT測量指南的規定[17]。

1.6 統計學分析

所有數據均以均數±標準差表示。使用K-S檢驗確定所有數據符合正態分布后，使用方差分析進行多組間的比較，如發現統計學差異，則使用LSD檢驗進行進一步的兩兩比較。兩組間的比較則使用獨立樣本t檢驗。P<0.05為具有統計學差異。上述計算使用SPSS 20.0軟件(SPSS Headquarters, Chicago, IL, USA)實現。

2 結果

2.1 DEXA測定的小鼠全身、脊柱及下肢BMD

12周小鼠的全身、脊柱及下肢BMD均較8周時有所升高，但差異無統計學意義(圖1A-C)。8周去勢組小鼠的術后6周及8周的全身和下肢BMD較術前顯著升高，隨后的時間點則可見BMD的緩慢下降(圖1D, 1F)。8周去勢組小鼠各時間點的脊柱BMD相比無統計學差異(圖1E)。12周去勢組小鼠各時間點的全身，脊柱及下肢BMD相比均無統計學差異(圖1G-I)。

2.2 micro-CT測量結果

micro-CT三維重建圖可見，兩組小鼠在去勢后，其脛骨近端骨微結構均隨著時間的推移而退化，且12周小鼠更為顯著(圖2)。定量分析的結果顯示：與8周相比，12周小鼠的脛骨近端Tb.N有顯著升高(圖3B)，Tb.Sp有顯著下降(圖3C)。8周去勢組的小鼠在術后8周首次觀察到BV/TV，Tb.N及Tb.Sp較術前的顯著性改變，上述參數的變化在隨后的時間點有所減緩(圖3D-F)。12周去勢組小鼠則在去勢6周后即可觀察到BV/TV，Tb.N及Tb.Sp的顯著性變化，上述參數在隨后的隨訪時間中進入平臺期(圖3G-I)。

3 討論

圖1 DEXA測量的8周及12周小鼠的全身、脊柱及下肢BMD(g/cm2)(A-C)對比。8周去勢組(D-F)及12周去勢組小鼠(G-I)各部位的各時間點的BMD(g/cm2)對比*P<0.05Fig.1 Comparison of the BMD (g/cm2) of total body, spine and lower extremity assessed by DEXA between 8-week-old mice and 12-week-old mice (A-C), and the comparison among different time points in both groups (D-F: 8 w-OVX group, G-H: 12 w-OVX group).*indicated P<0.05 when comparing to the baseline.

圖2 8周去勢組及12周去勢組小鼠各時間點的代表性脛骨近端松質骨micro-CT三維重建圖(A: 8周去勢組, B: 12周去勢組)Fig.2 Representative micro-CT 3D reconstructed images of the proximal tibia obtained from each time points in both groups (A: 8 w-OVX group, B: 12 w-OVX group).

圖3 8周小鼠的骨體積分數(BV/TV，%)，骨小梁數目(Tb.N，1/μm)和骨小梁分離度(Tb.Sp，μm)與12周小鼠的對比(A-C)。8周去勢組(D-F)及12周去勢組(G-I)小鼠組內各時間點之間BV/TV(%)， Tb.N(1/μm)和Tb.Sp(μm)的比較。與基線相比時，*P<0.05，**P<0.01。與前一個時間點相比時，# P<0.05，## P<0.01。Fig.3 Comparison of t BV/TV (%), Tb.N (1/μm), and Tb.Sp (μm) of the proximal tibia between 8-week-old mice and 12-week-old mice (A-C), and the comparison among different time points in both groups (D-F: 8 w-OVX group, G-I: 12 w-OVX group). *indicated P<0.05 and **indicated P<0.01 when comparing to the baseline.#indicated P<0.05 and ##indicated P<0.01 when comparing to the former time point.

DEXA測量的脊柱、股骨近端及髖部BMD是美國骨質疏松指南小組推薦的臨床診斷骨質疏松癥的金標準，同時也是目前評估動物(兔、大鼠等)BMD及骨礦鹽含量應用最為廣泛的非侵入性檢測技術[18-20]。既往的研究發現，DEXA測量的大鼠肱骨標本骨礦鹽含量與骨灰量測定法的結果有顯著的相關性(r=0.988)[21]。DEXA還可檢測出小動物脛骨骨礦鹽含量最小低至0.004 g，BMD最小低至0.003 g/cm2的變化[22]。但近期有研究者發現，在使用DEXA測量體重僅為20～30 mg的小鼠骨量時會存在較大誤差。與骨灰量測定法相比，DEXA測得的小鼠股骨及脛骨的骨礦鹽含量分別有最高達68%及107%的增加，且兩種方法的測量結果無明顯的相關性。研究者認為，小鼠骨骼尺寸較小、骨量較低，會增加DEXA分辨骨骼及周圍軟組織的難度，最終影響DEXA測量結果的準確性[23]。此外，雖已有為小動物BMD測量而設計的專用軟件，但測量過程仍需較多的人工操作，難以避免會存在一定的偏倚。絕經后骨質疏松癥以骨量減少，骨微結構退化為特征，而微結構的退化從形態學觀察主要表現為骨小梁變薄、變細，甚至斷裂。因此，骨小梁也是骨質疏松動物模型非常重要的觀察指標[24]。micro-CT的最高分辨率可達微米級，可提供足夠的精度供其對小鼠的骨小梁(寬度約為30～50 μm)等微結構進行精確測量[25]。此外，研究者還發現micro-CT與骨標本組織形態學的測量結果具有良好的一致性[26]。micro-CT是非侵入性檢查方法，與骨標本組織形態學相比，還具有可對小鼠進行多次重復檢查，動態觀察骨微結構變化的優勢。骨質疏松領域權威雜志《Journal of Bone and Mineral Research》2010年發表的《運用micro-CT評價嚙齒類動物骨微結構指南》也推薦micro-CT作為評估小鼠及其他小動物骨形態及骨微結構的金標準[17]。本研究的結果發現，在12周小鼠去勢6周后，micro-CT已發現脛骨近端骨微結構明顯的惡化及相關參數的顯著下降，但DEXA測量的BMD仍較術前無顯著的變化。鑒于C57/BL6J小鼠的BMD均低于目前常用的小鼠種屬(C3H, CD-1及SW)[27]。故我們認為，本研究中出現的DEXA測量的BMD結果與micro-CT測量結果并不完全一致的現象與C57/BL6J小鼠BMD較低，DEXA未能對其進行精確測量有關。綜上所述，與DEXA相比，micro-CT更適合于評估小鼠模型的BMD及骨微結構變化。

小鼠8周～12周時體成熟并具有繁殖能力，此時卵巢切除術對其骨量的影響顯著[28]。在12周之前，小鼠長骨生長迅速，骨形態、骨礦質量及骨生物力學等指標快速增加，其脛骨總BMD、皮質骨BMD與小鼠周齡有顯著的相關性；12周～42周期間，小鼠骨代謝進入平穩期，上述指標趨于穩定[29]。Glatt等的研究也得到類似的結果：C57/BL6J雄性及雌性小鼠的全身BMD均在12周前有顯著的升高，并在隨后的24周內保持穩定的水平[30]。本研究的結果也發現，12周小鼠脛骨近端的骨微結構參數顯著高于8周小鼠，與既往研究結果相符。因此我們認為，8周的C57/BL6J小鼠雖然已接近體成熟，但仍處于生長發育階段，骨代謝活躍，骨礦鹽含量、BMD及骨微結構參數仍隨周齡的增大而顯著增加，對卵巢切除術誘導的骨量丟失有一定的影響，故其建立骨質疏松模型所需的時間可能較長。進一步的結果也證實了這一假設，12周去勢組小鼠在去勢6周后即出現脛骨近端骨微結構參數的顯著變化，而8周去勢組小鼠則需要8周。總而言之，考慮到建模的成功率及建模時間，本研究認為12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠絕經后骨質疏松模型的合適時機。

本研究存在一定的局限性。首先，離體標本的micro-CT測量僅提供了小鼠特定時間點的BMD及骨微結構參數信息，活體micro-CT可提供對小鼠BMD變化的連續縱向的評估，可有效降低誤差。其次，對小鼠外觀變化，脛骨標本組織學分析及骨轉換標志物水平的測量可提供小鼠在卵巢切除術后骨重塑方面的更多的信息，下一步的研究將繼續完善上述內容。

綜上所述，與DEXA相比，micro-CT更適合于評估小鼠模型的BMD及骨微結構變化。考慮到建模的成功率及建模時間，本研究認為12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠絕經后骨質疏松模型的合適時機。