ERK5信號通路介導流體剪切力對MC3T3-E1成骨細胞MMPs、TIMPs表達的影響

楊全增 張成俊 丁寧 李忠浩 夏亞一*

1. 蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000

2. 甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

適宜的機械應力可以刺激成骨細胞，介導骨組織的重建，通常機體能感受到的機械應力有牽張應力、壓應力、FSS、電磁力及離心力等[1]。FSS是一種存在廣泛、研究較為充分的機械應力，正常活動對骨組織施加的機械應力刺激可引起骨組織腔隙結構內液體的流動，形成FSS，最終導致成骨細胞增殖及分化[1]。細胞外信號調節激酶5(extracellular signal regulated kinase，ERK5)信號通路是目前發現的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族新成員，它可以被應激、生長因子和應力刺激等干預措施激活，參與細胞的增殖、分化和凋亡等[2]。我們實驗室前期研究已發現 ERK5 信號通路可被FSS激活，從而參與細胞的增殖[2]、分化[3]和抑制凋亡[4]等過程。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可以降解骨基質，基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)可以抑制MMPs的功能，MMPs和TIMPs之間保持平衡有利于骨重建的正常進行[5]。但是，FSS是否通過 ERK5 信號通路調節MMPs和TIMPs的表達水平，目前還不清楚。本研究將采用ERK5 特異性阻斷劑 XMD8-92 干預成骨細胞，觀察FSS對成骨細胞 MMPs 和 TIMPs 表達的影響，并探討ERK5 信號通路在這一過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗細胞：MC3T3-E1 細胞(中國醫學科學院)。試劑：胎牛血清(PAN-Biotech，德國)；α-MEM培養基(Hyclone 公司，美國)；磷酸鹽緩沖液PBS(中杉金橋，中國)；胰蛋白酶(Sigma 公司，美國)；青霉素-鏈霉素雙抗(武漢博士德，中國)；RIPA 強力細胞裂解液(碧云天生物技術有限公司，中國)；PMSF(Genview，美國)；鼠β-actin一抗(Sigma，美國)；兔MMP-1-抗(Abcam，英國)；兔MMP-3-抗(Abcam，英國)；兔MMP-13-抗(Abcam，英國)；鼠TIMP-1-抗(Abcam，英國)；兔TIMP-2-抗(Abcam，英國)；兔TIMP-3-抗(Abcam，英國)；山羊抗兔二抗(中杉金橋，中國)；兔抗小鼠二抗(中杉金橋，中國)。實驗儀器：細胞培養箱(上海力申科學儀器有限公司，中國)；垂直電泳儀(Bio-Rad，美國)，電轉儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養：將小鼠MC3T3-E1細胞接種到無菌培養瓶中，α-MEM 培養基中添加10% 胎牛血清和 100 U/mL青-鏈霉素制成完全培養基，在溫度37 ℃、CO2飽和度5%的培養箱中孵育細胞，每隔2 d～3 d換液1次，待細胞融合至80%～90%時，用0.25%胰酶消化，接種至細胞培養瓶中繼續傳代培養。

1.2.2加載流體剪切力(FSS)：加載FSS時使用的是我們實驗室設計的數字化多通道 FSS 加載系統(實用新型專利號：ZL201520637211.6)，該系統主要包括：計算機控制系統、6個密閉加力小室、醫用硅膠管道、蠕動泵、儲液柱、硅膠墊圈及螺絲等。在顯微鏡下觀察培養瓶中的成骨細胞，選擇生長達80%～90%時以上融合的成骨細胞，將細胞培養瓶中的成骨細胞用胰酶作用后，輕輕吹打成細胞懸液。將吹打好的細胞懸液(濃度約為4 000個/ mL)接種于20 mm×50 mm無菌蓋玻片上，靜置約1 h待細胞完全貼壁后加入培養基繼續培養。待細胞融合至80%～90%后，放置蓋玻片到密閉加力小室中，組裝層流流體小室，并將其連接到儲液柱和蠕動泵上。向儲液柱中加入200 mL預熱(37 ℃)的α-MEM基礎培養基，以蠕動泵為動力，在時效試驗時，加載大小為12 dyn/cm2的FSS，分別作用0、15、30、45、60 min，在后續實驗中加載FSS 45 min。

1.2.3蛋白質免疫印跡實驗(Western blotting)：迅速吸除成骨細胞的培養液，用預冷(4 ℃)的 PBS 輕柔沖洗細胞 3 次，然后吸凈培養瓶或是玻片中的 PBS 液體。接著加入 RIPA和PMSF的混合液(100∶1)裂解細胞，置于冰上緩慢搖晃30 min 后，用細胞刮刀刮下，將細胞收集于1.5 mL的EP管中。然后，在 4 ℃ 12 000 r/min 條件下離心 15 min，用移液器緩慢吸取上清液于EP管中，加入上清液1/3體積量的蛋白上樣緩沖液，立即在沸水中煮沸3 min～5 min，然后放到-80 ℃冰箱冷藏。以β-actin作為內參；配制聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE凝膠)，然后經過上樣、電泳、電轉、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、曝光等步驟得到條帶。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 加載不同時間FSS對MMP-1 和TIMP-1 蛋白表達的影響

我們課題組前期研究已表明，12 dyn/cm2FSS是對成骨細胞最適宜的刺激，為了尋求最佳的FSS加載時間，對MC3T3-E1細胞加載12 dyn/cm2FSS 分別作用0、15、30、45、60 min，采用 Western blotting方法檢測MMP-1和 TIMP-1蛋白表達的情況，以β-actin 作為內參。如圖1～圖3所示，MMP-1和TIMP-1蛋白的變化呈現時間依賴性。MMP-1從15 min 開始逐漸增加，差異有統計學意義(P<0.01)，在45 min達到高峰，60 min已經開始下降，但仍然高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，TIMP-1在15 min時表達量開始下降，在45 min時降到最低，差異有統計學意義(P<0.01)；在60 min時表達量又上調。這說明在MC3T3-E1成骨細胞中，隨著FSS加載時間的延長，FSS可以上調MMP-1的表達，下調TIMP-1的表達，加載45 min作用最明顯，因此在后續實驗中選用45 min的FSS加載時間。

圖4 XMD8-92及FSS對P-ERK5表達的影響注：*P<0.05；**P<0.01Fig.4 Effect of XMD8-92 and FSS on the expression of P-ERK5Note:*P<0.05；**P<0.01

圖1 FSS對成骨細胞內的 MMP-1和TIMP-1 蛋白表達的影響Fig.1 Effect of fluid shear stress on the expression of MMP-1 and TIMP-1 in osteoblasts

圖2 FSS對成骨細胞內MMP-1表達的影響注：*P<0.05；**P<0.01Fig.2 Effect of fluid shear stress on the expression of MMP-1 in osteoblastsNote:*P<0.05；**P<0.01

圖3 FSS對成骨細胞內TIMP-1表達的影響注：*P<0.05；**P<0.01Fig.3 Effect of fluid shear stress on the expression of TIMP-1 in osteoblastsNote:*P<0.05；**P<0.01

2.2 XMD8-92及FSS對P-ERK5表達的影響

我們實驗室前期研究已發現，加載FSS 45 min可以完全激活MC3T3-E1細胞中的ERK5，即促進ERK5的磷酸化水平，XMD8-92為ERK5 特異性的抑制劑；如圖4所示，為了檢測 FSS 對MC3T3-E1細胞內ERK5活化的影響，加載12 dyn/cm2的FSS作用45 min，可以明顯促進MC3T3-E1細胞內ERK5的磷酸化，即P-ERK5/ERK5比例明顯上升(P<0.01)；用5 μmol XMD8-92預處理MC3T3-E1細胞1 h，Western blotting結果發現XMD8-92不僅能抑制正常 MC3T3-E1細胞中的ERK5 的活化(P<0.05)，而且能抑制FSS誘導的P-ERK5的表達(P<0.01)，這與我們以前的實驗結果一致。

2.3 XMD8-92及FSS對MMPs表達的影響

為了檢測FSS對MC3T3-E1細胞MMPs表達的影響，加載12 dyn/cm2的FSS作用45 min，如圖5～圖8所示，可以明顯上調MC3T3-E1細胞MMP-1、MMP-13的表達(P<0.001)和MMP-3的表達(P<0.05)；用5 μmol XMD8-92預處理MC3T3-E1細胞1 h，Western blotting結果發現XMD8-92不僅能下調正常MC3T3-E1細胞中的MMP-1、MMP-3的表達(P<0.001)和MMP-13的表達(P<0.05)，而且能下調FSS誘導的MMP-1、MMP-13的表達(P<0.001)和MMP-3的表達(P<0.05)。

圖5 XMD8-92及FSS對MMPs表達的影響Fig.5 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMPs

圖6 XMD8-92及FSS對MMP-1表達的影響Fig.6 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMP-1

圖7 XMD8-92及FSS對MMP-3表達的影響注：*P<0.05；***P<0.001Fig.7 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMP-3Note:*P<0.05；***P<0.001

圖8 XMD8-92及FSS對MMP-13表達的影響Fig.8 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMP-13

2.4 XMD8-92及FSS對TIMPs表達的影響

為了檢測FSS對MC3T3-E1細胞TIMPs表達的影響，加載12 dyn/cm2的FSS作用45 min，如圖9～圖12所示，可以明顯下調MC3T3-E1細胞TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3的表達(P<0.05)，用5 μmol XMD8-92預處理MC3T3-E1細胞1 h，Western blotting結果發現XMD8-92不僅能上調正常MC3T3-E1細胞中TIMP-1、TIMP-2的表達(P<0.05)和TIMP-3的表達(P<0.001)，而且能上調FSS誘導的TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3的表達(P<0.05)。

圖9 XMD8-92及FSS對TIMPs表達的影響Fig.9 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMPs

圖10 XMD8-92及FSS對TIMP-1表達的影響Fig.10 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMP-1

圖11 XMD8-92及FSS對TIMP-2表達的影響注：*P<0.05；***P<0.001Fig.11 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMP-2Note:*P<0.05；***P<0.001

圖12 XMD8-92及FSS對TIMP-3表達的影響Fig.12 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMP-3

3 討 論

適宜的機械應力刺激對成骨細胞的功能和代謝起著重要的作用[6]，通常機體能感受到的機械應力有壓應力、牽張應力、剪切應力、離心力及電磁力等，正常骨組織的生長、重建以及骨折后的骨痂塑形等都與生理性或外加機械應力刺激密切相關[7]。FSS是一種存在廣泛、研究較為充分的機械應力，人體正常骨組織中存在大量的腔隙結構，這些結構中充滿了組織液，機體正常活動時對骨組織施加的機械應力將引起骨腔隙間液流動產生FSS，最終導致成骨細胞增殖及分化[8]。中等大小FSS作用30 min～60 min可刺激成骨細胞增殖，而較高的FSS反而則抑制成骨細胞增殖[9]。

MAPK家族是重要的信號傳導系統，主要包括ERK1/2、JNK、P38、ERK5以及ERK3/4[10]，ERK5信號通路是MAPK 家族中最新的成員，目前對其研究較少，MAPK信號轉導通路可以被應激、生長因子和應力刺激等干預措施激活，通過信號分子的磷酸化將細胞外信號轉化為細胞內信號，廣泛參與到細胞的增殖、分化以及凋亡等活動中[11]。我們實驗室前期研究表明，ERK5在FSS調節的成骨細胞增殖中發揮著重要作用[12]。

MMPs是存在于骨基質中的蛋白酶，可降解多種膠原和骨基質，在重建細胞外基質和維持正常的骨形態方面起著重要的作用；當骨組織受到較小的機械應力作用時，不能有效刺激骨基質的合成，長此以往則會導致骨量減少，形成骨質疏松；而過載的機械應力作用則會產生病理性編織骨，骨質發生增生硬化，骨細胞的生長也受到抑制，只有處于生理范圍內的機械力學刺激才能有效的促進成骨，介導骨組織的重建[13]。骨重建是通過骨吸收和骨形成兩種機制的偶聯進行，骨吸收包括骨基質的降解，成骨細胞產生的MMPs可以降解骨基質，TIMPs可以特異性的抑制MMPs的功能，MMPs和TIMPs之間保持平衡是有利于骨重建的正常進行[14]。

有研究表明FSS作用于成骨細胞，可以上調 MMPs 的表達，MMPs是存在于骨基質中的蛋白酶，可以降解細胞外基質，引起信號分子的釋放，誘導信號轉導的啟動，從而促進 Runx-2、c-fos/c-jun、Nmp4/CIZ 等基因的表達[15]。在本研究中，根據我們實驗室前期的研究，對MC3T3-E1成骨細胞加載12 dyn/cm2FSS 分別作用0、15、30、45、60 min，MMP-1和TIMP-1蛋白的變化呈時間依賴性；MMP-1從15 min 開始逐漸增加，在45 min達到高峰，60 min已經開始下降，TIMP-1在15 min時表達量開始下降，在45 min時降到最低，在60 min時表達量又上調。這說明加載FSS 45 min是最有效的刺激，FSS可以促進MC3T3-E1細胞中MMPs的表達，降解骨基質和Ⅰ型膠原，進而促進骨吸收；隨著FSS加載時間的延長，MMPs表達量上調，可以激活其特異性抑制因子TIMPs，從而抑制MMPs的功能以阻止其對骨基質和Ⅰ型膠原的過度降解，調節MMPS和TIMP-1保持平衡，維持機體正常的骨重建。有研究發現在人牙周韌帶干細胞中，FSS增加了MMP-1、MMP-2的表達，抑制TIMP-2的表達，用細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)阻滯劑干預后阻斷了FSS誘導的MMP-1的表達，這表明FSS誘導MMP-1的表達是通過ERK信號通路來調節的[16]。本研究結果表明，FSS加載45 min可以明顯促進MC3T3-E1細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達，下調TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3的表達，用ERK5 特異性抑制劑 XMD8-92 干預后減弱了FSS 對MMPs和TIMPs的作用，說明 ERK5信號通路參與了FSS對MMPs和TIMPs表達的調節。

ERK5信號通路具體是通過哪個靶點分子介導FSS對MC3T3-E1成骨細胞MMPs和TIMPs表達的調節，是否有其他通路參與其中，目前還不清楚，有待進一步的研究。骨質疏松癥等骨吸收性疾病與局部MMPs的異常表達密切相關，目前對MMPs的認識還很有限，希望通過更深入的研究，闡明其與原發性骨質疏松癥發病的關系，有助于研發MMPs抑制性藥物用于該類疾病的治療。