右歸丸對膝骨性關節炎模型鼠基質金屬蛋白酶及炎性因子表達的影響

顏春魯 李盛華 安方玉 劉永琦 夏鵬飛 馬正民 牛彥強 柳鵬瑤

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

2. 甘肅省高校中藏藥化學與質量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

膝骨性關節炎(osteoarthritis of the knee，KOA)主要病理特征以膝關節軟骨發生退變、軟骨基質發生降解為主，繼發滑膜炎癥和骨質增生，引發關節疼痛、腫脹及功能障礙，嚴重影響患者的生存質量。相關研究表明：關節內局限性炎癥的發生是引起骨性關節炎疼痛最主要的原因[1]，其中，基質金屬蛋白酶家族成員(MMPs)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)這幾種炎癥介質在KOA發病過程中都起著非常重要的作用[2-3]。本方右歸丸出自《景岳全書》，主要由附子、肉桂、鹿角、熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、菟絲子、杜仲、當歸等組成，主要功效以溫腎陽為主、陰陽兼顧、肝脾腎并補，妙在陰中求陽。主治腎陽虛弱，命門火衰所致之癥。依據中醫的腎主骨生髓理論，本實驗希望通過觀察右歸丸對KOA大鼠血清基質金屬蛋白酶家族成員(MMPs)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量水平的調節，來探討右歸丸的作用機制，從而為右歸丸臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1實驗動物：SPF級SD大鼠60只，體重(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心提供。實驗動物質量合格證編號：SYXK(甘)2015-0005。

1.1.2藥物和試劑：右歸丸(仲景宛西制藥股份有限公司，國藥準字Z41022170，批號：151108)；硫酸氨基葡萄糖片(保節力)，國藥準字H20041317，批號：160302，新興同仁藥業有限公司；Rat MMP-13 ELISA kit、Rat TIMP-1 ELISA kit、Rat MMP-1 ELISA kit、Rat MMP-3 ELISA kit、Rat TNF-α ELISA kit、Rat IL-1β ELISA kit和Rat IL-6 ELISA kit檢測試劑盒，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3實驗儀器：iMark型全自動酶標分析儀，美國Bio-Rad公司；FA2004N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；ZY12306型微量加樣器，ScienTiFic產品；DOG 0145A型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；TDZ5-WS型醫用離心機，湖南平凡科技有限公司；DW-86L338型超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1造模：60只SD大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表分為6組，隨機選取一組為假手術組，其余各組用改良Hulth法復制大鼠膝骨關節炎模型[4，5]。腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉各組大鼠后，雙側膝關節手術區常規消毒，無菌條件下將雙側膝關節內側縱向切開長約2 cm，逐層暴露關節腔，剔除膝前后交叉韌帶、內側副韌帶及內側半月板，注意關節軟骨面勿損傷。用潔凈的5 mL注射器吸取生理鹽水沖洗關節腔3～5次，行抽屜試驗陽性后徹底止血，逐層縫合。將假手術組SD大鼠從膝關節內側打開關節腔，不破壞韌帶，半月板，保留關節軟骨面。傷口在縫合前均滴入少量的青霉素溶液，隨后逐層縫合。術后連續3天肌肉注射青霉素20萬U/d，各組大鼠均在相同條件下，自由飲水，攝食。手術造模6周。

1.2.2動物分組及給藥：手術造模6周后，假手術組和模型組灌服蒸餾水，按人和動物的體表面積計算法，大鼠用藥劑量(g·kg/d)=人用劑量(g/d)/60 kg×0.018×5，硫酸氨基葡萄糖組0.17 g·kg/d灌服硫酸氨基葡萄糖，右歸丸低、中、高劑量組分別按1.2、2.4、4.8 g·kg/d灌服相應的藥物，干預8周。留取血清備用，并無菌條件下分離膝關節，部分膝關節分裝于含4%的多聚甲醛的磨口瓶中，用于組織形態學觀察，并進行Mankin評分。

1.2.3一般情況：觀察大鼠的飲食，飲水，活動度，靈敏度，精神狀態，膝關節的畸形、腫脹、活動情況，雙下肢肢端血運及肌肉豐滿程度。

1.2.4關節軟骨形態學變化的觀察：將脫鈣后膝關節軟骨切片用包石蠟包埋，制作成5 μm厚的切片，HE染色，鏡檢并進行Mankin 評分[6]。具體評分如下：0分，軟骨結構光整如常，軟骨細胞數量如常，基質染色正常，潮線比較完整；1分，軟骨表面有不規則裂隙，軟骨細胞數量彌漫性增多，基質染色減退，出現多重潮線；2分，軟骨裂隙深達肌層，軟骨細胞成簇生長，基質染色明顯減退，軟骨下血管浸入肌層；3分，軟骨裂隙深達輻射層，軟骨細胞數量明顯減少，基質染色明顯減退；4分，軟骨裂隙深達鈣化層，基質染色完全消失；5分，軟骨層脫落。

1.2.5血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TIMP-1含量的測定： 股動脈采血，靜置2 h，1500rpm離心，8-10 min，取血清，ELISA法測定血清基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)吸光度值、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)吸光度值、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)吸光度值和基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)吸光度值，并通過標準曲線的繪制求出各自的計算公式：MMP-1方程為Y=0.0004X+0.0435，MMP-3方程為Y=0.0108X+0.0391，MMP-13方程為Y=0.0005X+0.0478，TIMP-1方程為Y=0.0058X+0.0395。將各測定樣品的OD值分別代入上述方程求出相對應的MMP-1濃度、MMP-3濃度、MMP-13濃度和TIMP-1濃度。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.6血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量的測定：血清制備方法同1.2.5，ELISA法測定血清白細胞介素-1β(IL-1β)吸光度值、白細胞介素-6(IL-6)吸光度值和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)吸光度值，并通過標準曲線的繪制求出各自的計算公式：IL-1β方程為Y=0.005X+0.0441，IL-6方程為Y=0.0032X+0.0381，TNF-α方程為Y=0.0007Χ+0.0516。將各測定樣品的OD值分別代入上述方程求出相對應的IL-1β濃度、IL-6濃度和TNF-α濃度。具體操作按照試劑盒說明書進行。

圖1 膝骨性關節炎關節軟骨的病理形態變化(HE 200×)注：A：假手術組；B：模型組；C：右歸丸低劑量組；D：右歸丸中劑量組；E：右歸丸高劑量組；F：硫酸氨基葡萄糖組Fig.1 The pathomorphological changes of articular cartilage of knee osteoarthritis (HE, 200×)

2 實驗結果

2.1 一般情況

實驗期間未出現動物死亡現象。實驗期間假手術組大鼠飲食、飲水、活動如常，反應比較靈敏，精神狀態良好，膝關節未出現畸形、腫脹、活動良好，雙下肢肢端血運正常及肌肉未發生萎縮；模型組大鼠飲食、飲水、活動情況、靈敏度及精神狀態均明顯變差，膝關節出現畸形、腫脹，雙下肢端血運變差及肌肉發生萎縮；右歸丸各干預組及硫酸氨基葡萄糖組大鼠飲食、飲水、活動情況較模型組較好，靈敏度及精神狀態也有所好轉，膝關節腫脹程度、肌肉萎縮程度均較模型組顯著改善，肢端血運明顯恢復。

2.2 膝關節關節軟骨形態學變化的觀察

圖1結果顯示，假手術組大鼠關節面完整、光滑，滑膜完整，軟骨細胞排列整齊，呈水平排列；軟骨周圍細胞較小扁平形，排列密集，其長軸平行于軟骨表面；中心細胞較大呈圓形或橢圓形，同源細胞群排列；模型組大鼠關節面破損嚴重，軟骨組織大量脫落，軟骨細胞排列紊亂，有簇聚現象，細胞數目增多，空泡變大；各干預組大鼠軟骨細胞排列紊亂，由平行排列變為縱行排列，纖維化，細胞數目增多。其中，右歸丸高劑量組大鼠骨小梁形態以及結構明顯改善，軟骨細胞排列整齊，分布均勻，鈣化層軟骨細胞輕度成簇，潮線尚完整。表1結果顯示：與假手術組比較，模型組和藥物各干預組大鼠Mankin評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠Mankin評分均明顯降低(P<0.05)。

2.3 血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TIMP-1含量的測定

表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清MMP-1、MMP-3和MMP-13含量升高，TIMP-1含量降低(P<0.05)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠血清中MMP-1、MMP-3和MMP-13含量均降低，TIMP-1含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組動物關節軟骨 Mankin 評分結果比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

Note:#P<0.05 compared with sham group;*P<0.05 compared with model group

表2 各組動物血清MMP-1、MMP-3、MMP-13和TIMP-1含量比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

Note:#P<0.05 compared with sham group;*P<0.05 compared with model group

2.4 血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量的測定

表3結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高(P<0.05)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組動物血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

Note:#P<0.05 compared with sham group;*P<0.05 compared with model group

3 討論

中醫學認為，膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)屬于“骨痹”、“痹證”、“筋痹”等范疇，主要因氣血不足，肝腎虧虛，風寒濕侵入骨髓，痹阻經絡導致筋骨失養，并將其分為陽虛寒凝、肝腎虧虛、腎虛髓虧、氣滯血瘀等類型，治法以補腎壯骨、益氣活血為主[7]。右歸丸出自《景岳全書》。本方所治之癥為腎陽虛弱，命門火衰所致。方中附子、肉桂、鹿角膠培補腎中元陽，溫里祛寒，為君藥。其中，附子湯可有效減輕輕中度 KOA 寒濕痹阻證患者的膝關節疼痛癥狀[8]。熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎，養肝補脾，填精補髓，取“陰中求陽”之義，為臣藥。再用菟絲子、杜仲補肝腎，強腰膝，配以當歸養血和血，共補肝腎精血，為佐藥。其中，杜仲、當歸等活血、溫經及補益肝腎中藥均能通過改善膝骨關節炎兔膝關節軟骨形態來達到保護軟骨、延緩軟骨退變的目的[9]。因此，選用本方為干預藥物，來初探本方治療KOA的作用機制。

本研究結果顯示，模型組大鼠Mankins評分顯著高于假手術組，各干預組大鼠Mankins評分均低于模型組，并且均高于假手術組；并且病理形態學改變也顯示：模型組大鼠軟骨組織大量脫落，軟骨細胞數目增多，空泡變大，排列紊亂，出現簇聚現象，而右歸丸高劑量組大鼠骨小梁形態以及結構明顯改善，軟骨細胞排列整齊，分布均勻，鈣化層軟骨細胞輕度成簇，潮線尚完整。提示右歸丸治療膝骨性關節炎有效，以右歸丸高劑量組作用最為明顯，說明右歸丸高劑量組療效優于右歸丸低、 中劑量組。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一類參與降解軟骨基質中膠原和蛋白多糖等物質的蛋白酶類家族，主要包括MMP-1、MMP-3、MMP-13等。其中，MMP-1和MMP-13稱為膠原酶，可降解I、II、III型膠原。MMP-3被稱為間質溶解素，主要水解Ⅳ型膠原、蛋白聚糖、明膠及糖蛋白等物質。此外，正常個體軟骨組織的基質中存在有金屬蛋白酶抑制物(Matrix metalloproteinase inhibitor，TIMPs)，是一種能夠與MMPs 形成復合物，從而抑制絕大多數的MMPs的低分子生理性抑制劑[10]。正常個體，MMP和TIMP維持著動態平衡，進而進一步維持軟骨細胞的生理功能；當某種原因導致機體的MMP異常增高，TIMP異常降低，從而使軟骨組織內基質的降解速率大于合成速率時，打破了二者之間的平衡，導致軟骨發生退變，進而發生KOA。近年來還發現，在KOA發病進程中，細胞因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α等在維持二者的動態平衡中發揮了重要作用。IL-1β能夠促進MMP基因的表達和刺激軟骨細胞和滑膜細胞產生一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)，導致炎癥反應[11-12]。IL-1和TNF-α還可以協同通過刺激滑膜細胞分泌PGE2進一步促進MMPs 家族的產生，促進軟骨吸收[13]。IL-6通過促進TIMP的產生來拮抗MMP對軟骨基質的降解作用，促進軟骨細胞增殖[14]。本實驗結果顯示：模型組大鼠血清中MMP-1、MMP-3、MMP-13、IL-1β、IL-6、TNF-α含量較假手術組明顯增加，TIMP-1含量明顯下降，結果與大多數研究一致[7，11-16]。這一結果證明，炎癥細胞因子的產生打破了MMP和TIMP之間的動態平衡，導致KOA的發生。 給予右歸丸干預后，高劑量組大鼠血清中MMP-1、MMP-3、MMP-13、IL-1β、IL-6、TNF-α含量下降，TIMP-1含量升高，提示，右歸丸可能是通過抑制機體IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子產生，減輕關節炎癥反應，進一步降低MMP和提高TIMP的的含量表達，從而達到減輕關節疼痛，消除臨床癥狀進而改善關節功能的作用。

綜上所述，右歸丸對KOA 具有明顯的防治作用，主要通過抑制炎癥介質的釋放間接增強TIMP的的含量表達和進一步降低MMPs的含量表達，來實現對關節軟骨細胞保護作用、促進軟骨細胞蛋白多糖的合成和阻止軟骨內膠原纖維的降解、維持軟骨組織的正常形態和功能，從而減輕關節軟骨的損傷，延緩骨關節炎的發展進程，為右歸丸的臨床應用提供了理論依據。