血清p53自身抗體在乳腺癌中的診斷價值

楊時煌 羅育豪 翁雪芬 彭裕輝 許鎰洧

(汕頭市龍湖區第二人民醫院急診科，廣東 汕頭 51500)

近年來歐美國家乳腺癌的死亡率逐年下降，其中早期篩查和早期診斷發揮了重要作用〔1〕。早期發現乳腺癌，可顯著提高患者生存率，并且增加患者保乳治療率。尋找乳腺癌早期診斷血清/血漿分子標志物，無疑將有助于早期發現乳腺癌。近10年來的研究發現，針對腫瘤相關抗原的自身抗體標志物有望成為腫瘤早期診斷血清分子標志物〔2～4〕。本研究分析乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者和正常對照者p53自身抗體的血清水平，探討血清p53自身抗體與乳腺癌的相關性及診斷價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 于2012年10月至2013年6月，在汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院乳腺中心收集乳腺癌患者125例和乳腺良性腫瘤患者33例。所有患者均為治療前患者，并經過活組織病理學檢查確診。125例乳腺癌患者均為女性，年齡40～72歲，中位年齡51歲。33例乳腺良性腫瘤患者均為女性，年齡31～68歲，中位年齡46歲。正常對照組為116例年齡與乳腺癌患者匹配的女性體檢者，并被證實無任何腫瘤相關疾患，年齡41～70歲，中位年齡50歲。所有標本均經醫院倫理委員會的批準，患者均知情并同意。所有的受試者均在早晨空腹行靜脈采血，采集3 ml，靜置30 min后離心(3 500 r/min)10 min，分離得到的血清在低溫冰箱-80℃保存。

1.2儀器和檢測試劑 酶標儀(賽默飛公司品牌)，酶標板(96孔，江蘇海門浩天生物器材廠)，人p53重組蛋白和兔抗p53多克隆抗體(舟山同生生物科技公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgG或羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)，3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB，廈門英科新創公司)。

1.3p53自身抗體的檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中p53自身抗體。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將人p53重組蛋白稀釋到0.1 μg/ml，包被于酶標板，4℃過夜。棄去酶標板孔內液體，采用自制含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)對酶標板洗板3次。酶標板各孔加入封閉液200 μl(1%牛血清白蛋白+PBST)，孵育1 h(37℃)，洗板。加入100 μl受試者血清樣品(1∶110稀釋)和質控樣品(50例乳腺癌患者的血清混合制成)，封閉液作為陰性對照，兔抗p53多克隆抗體作為陽性對照，所有檢測均做兩平行孔，并與溫箱孵育1 h(37℃)，洗板；加入辣根過氧化物酶(HRP)羊抗人IgG或羊抗兔IgG(均為1∶10 000稀釋)，孵育1 h(37℃)，洗板5次；最后，每孔加入顯色液100 μl(TMB-過氧化氫)，顯色15 min(37℃避光)；加入終止液50 μl，酶標儀在測定波長為450 nm、校正波長為630 nm時檢測各樣品的A值(即A450 nm/A630 nm)。判斷臨界值(Cutoff值)：116例正常對照組血清p53自身抗體檢測OD值的均數加上2倍標準差(sd)，陽性為≥臨界值，陰性<臨界值。

2 結 果

2.1血清p53自身抗體在乳腺癌、乳腺良性腫瘤患者和正常對照組中的水平 血清p53自身抗體的平均滴度水平在乳腺癌組、乳腺良性腫瘤組和正常對照組中分別為0.159±0.252、0.060±0.053和0.045±0.037。與正常對照組相比，血清p53自身抗體的平均滴度水平比乳腺癌組和乳腺良性腫瘤組均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。進一步分析顯示，在乳腺癌組，血清p53自身抗體的平均滴度水平比乳腺良性腫瘤組升高，差異也有統計學意義(P<0.05，圖1)。

2.2p53自身抗體檢測乳腺癌的診斷價值 ROC曲線分析顯示(圖2)，p53自身抗體區分乳腺癌和正常對照組的AUC值為0.715(95%置信區間：0.652～0.779)，區分乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者的AUC值為0.625(95%置信區間：0.527～0.724)。根據Cutoff值的判斷標準，p53自身抗體對乳腺癌的診斷Cutoff值為0.119。此時，檢測p53自身抗體區分乳腺癌患者和正常對照組的敏感度為32.8%，特異度為95.7%；區分乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者的敏感度為32.8%，特異度為87.9%。

圖1 p53自身抗體在各組血清中的水平

圖2 血清p53自身抗體區分乳腺癌和正常對照組(A)及乳腺癌和乳腺良性腫瘤(B)的ROC曲線圖

3 討 論

乳腺癌患者5 年生存率與腫瘤分期密切相關。張敏璐等〔4〕的研究表明，早期乳腺癌5年生存率為98.3%，中期乳腺癌為83.5%，伴遠處轉移者僅為23.3%。由此可見，早期發現乳腺癌對提高患者總體生存率意義重大。目前，臨床上常用的乳腺癌相關腫瘤標志物，如癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原(CA)153等，在晚期乳腺癌具有較高的敏感性，但這些標志物的陽性率在早期乳腺癌中并不高。近年來研究證實，在不同類型的腫瘤患者，無論早期或晚期，對比正常人群，均可檢測到血清針對腫瘤相關抗原的自身抗體水平提高〔5〕，提示自身抗體檢測在惡性腫瘤血清學早期診斷方面的潛在應用前景。在乳腺癌方面，有研究表明自身抗體可以在乳腺癌發病前5年的無癥狀階段被檢測出陽性結果〔6〕。Dyachenko等〔7〕研究發現，與正常對照者相比，Zuotin相關因子(ZRF)自身抗體和R序列包含蛋白(KRR)1自身抗體在早期乳腺癌患者血清中的水平均顯著升高。這些研究提示，腫瘤自身抗體在乳腺癌患者血清中是存在的，有潛力作為一種有效的乳腺癌早期診斷方法。

p53基因是一種抑癌基因，是細胞生長重要的負調節因子。p53的功能與腫瘤發生發展、細胞凋亡等關系密切。人類腫瘤中，p53突變是最常見的基因突變，50%以上的腫瘤會出現該基因突變。研究提示，腫瘤自身抗體的產生與腫瘤相關抗原的突變、過表達和翻譯后修飾等密切相關〔8～10〕。血清p53自身抗體在絕大多數惡性腫瘤患者(如食管癌、肝癌、結直腸癌等)中水平升高〔11，12〕。在乳腺癌方面，Liu等〔13〕發現p53自身抗體在102例乳腺癌患者和146例正常對照者中的診斷敏感性為24.5%，特異度為90.0%；其中，在早期乳腺癌患者，其診斷敏感度為22.8%。Yang等〔14〕的研究證實，p53自身抗體對乳腺癌的診斷敏感度為31%，特異度為100%。本研究表明p53自身抗體不僅可以區分乳腺癌患者和正常對照者，而且有助于區分良惡性乳腺腫瘤。

綜上所述，本研究提示p53自身抗體與乳腺癌患者存在相關性，具有一定的診斷價值。然而，p53自身抗體對乳腺癌的診斷敏感度較低，即使血清p53自身抗體檢測能最終用于對乳腺癌患者的早期發現，也必須聯合其他自身抗體等分子標志物，進一步提高診斷敏感度，并通過大樣本、多中心研究進行驗證。