煙堿型乙酰膽堿受體亞單位a5基因多態性與吸煙老年人肺癌的關系

解寶泉 黃 艷 張志艷 王 袁 郭 霞 王紅陽

(華北理工大學附屬醫院呼吸科，河北 唐山 063000)

流行病學研究顯示肺癌以男性、吸煙病人居多，且發病年齡多在60歲以后，成為造成老年人死亡的第一位癌癥殺手〔1〕。肺癌發生是環境和遺傳因素協同作用的結果。研究顯示人類第15號染色體長臂15q24-25區域上編碼的煙堿型乙酰膽堿受體的候選基因簇即尼古丁受體家族(CHRNA3-CHRNA5-CHRNAB4，CHRNA3/5)與吸煙行為導致肺部疾病密切相關，但有關煙堿型乙酰膽堿受體基因位點突變與肺癌的關系目前尚有爭議〔2，3〕。本研究采用病例對照研究方法，分析煙堿型乙酰膽堿受體亞單位a5(CHRNA5)-rs 17486278位點基因多態性與吸煙老年人肺癌的關聯性，為肺癌病因的研究提供流行病學依據。

1 對象與方法

1.1對象 2011年1月至2016年1月華北理工大學附屬醫院確診的216例男性、吸煙的老年原發性肺癌患者為研究對象，年齡60～80歲；按照年齡±2歲、同性別進行1∶3配對抽取健康體檢人群648例，后期采集血標本基因測序過程中9例患者血液凝固未完成實驗，被剔除，對照組樣本有效率98.6%，符合實驗要求，對照組最終入組人群639例，年齡61～79歲。病例組入選標準：①病理組織學確診為原發性支氣管肺癌，參照WHO肺癌組織學分型標準分為鱗癌、大細胞癌、小細胞癌、腺癌、腺鱗癌及其他；②單一肺癌，未合并其他腫瘤；③知情同意。對照組入選標準：①與病例無血緣關系；②無慢性非傳染性疾病者；③知情同意。

1.2方法 由統一培訓的調查員進行面訪調查，現場回收問卷。

1.2.1一般資料 吸煙史(持續1年或1年以上者認定為吸煙)、飲酒(平均每周飲白酒1兩及以上，或相當酒精含量的其他酒類，并連續飲1年以上者)、工作環境(是否接觸有害物質如長期接觸醫源性X線、工作中煤塵、玻璃纖維、橡膠制品、塑料加工等)、是否合并慢性肺部疾病(如支氣管炎、慢性阻塞性肺部疾病、肺結核及塵肺等)、家族腫瘤史等。

1.2.2CHRNA5基因多態性 采集5 ml清晨空腹靜脈血標本，置-80℃低溫冰箱貯存。按試劑盒說明書進行DNA抽提(血液基因組提取試劑盒：BiomigaSanDiego，CA)。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)檢測各基因各位點的基因型。操作流程：配制質量分數為3%的瓊脂糖凝膠，內含0.5 μg/ml的溴乙錠。取擴增產物5 μl加電泳載樣液少量(6倍上樣緩沖液)，120 V電壓泳動30 min，于凝膠成像系統下觀察，根據PCR產物泳動的距離，參照DNA標準分子量泳動的位置確定擴增效果。將已擴增出來的DNA產物用限制性酶進行酶切后，判斷擴增產物的基因型。內切酶NIaⅢ0.4 μl，PCR擴增產物5 μl，10×NEB緩沖液1.2 μl，100×牛血清白蛋白(BSA)緩沖液0.12 μl，滅菌雙蒸水5.28 μl，混合后，置37℃水浴消化3 h。15 ml Tris硼酸(TBE)緩沖液中加入6 g瓊脂糖，電磁爐上加熱溶解，溶解后冷至60℃，加入2 μl EB染料，倒入已插入梳子的制膠槽中，待其冷卻凝固后待用。取5 μl酶切產物，加6倍上樣緩沖液少量，混合后，瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳60 min，于凝膠成像系統下觀察，根據條帶數(與標準分子量對照)確定其基因型。

1.2.3應對方式 采用醫學應對問卷(MCMQ)進行評測。該量表共20個條目3個維度：面對、回避和屈服。20個條目均按1～4四級計分，其中第1，4，9，10，12，13，18，19條等8個條目需反評計分?！懊鎸Α绷勘矸钟?，2，5，10，12，15，16，19 等條目分累計；“回避”量表分由3，7，8，9，11，14，17等條目分累計；“屈服”量表分由4，6，13，18，20等條目分累計。按各分量表的總分計分。通過對這3個分量的評分，計算各維度平均分值，平均分值/各維度滿分，計算出患者相對得分，以評估3類應對策略，某分量表相對得分越高，表明個體越傾向于采用這種應對方式。由于樣本量有限，將傾向于面對應對方式確定為積極應對，將回避、屈服應對方式確定為消極應對〔4〕。

1.2.4營養認知行為 根據最新公布的《中國居民膳食指南》，以胡倩倩等〔5〕研制營養(K-A-P)問卷為藍本，修改其中有關孕婦的膳食理念為老年人膳食基本原則，修改孕婦營養素來源為老年人常見疾病，包括癌癥與營養素等。對老年人營養知識、態度、行為調查。共30題，每題2 分共60分，≥40分判定營養認知行為良好，<40分為差〔5〕。

1.3統計學分析 用SPSS19.0統計軟件處理，兩組間樣本均數的比較采用t檢驗，計數資料比較用χ2檢驗，各相關因素與肺癌的關系用條件Logistic回歸模型行多因素統計分析。

2 結 果

2.1兩組相關因素比較 兩組年齡、文化程度、婚姻情況方面差異無統計學意義(P>0.05)；兩組吸煙年限、每天吸煙量、是否飲酒、是否有腫瘤家族史、是否存在職業有毒物質暴露危險、是否合并肺部慢性疾病、應對方式及營養認知行為方面，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組人群相關因素比較(n)

1)為t檢驗，其他為χ2檢驗；2)合并肺結核、慢性阻塞性肺疾病、塵肺等

2.2兩組CHRNA5-rs 17486278位點基因類型和基因頻率比較 兩組均可檢測到CHRNA5-rs 17486278位點基因片段，且符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P>0.05)。CHRNA5-rs 17486278位點基因型包括野生型(AA)、雜合變異型(AC)、純合變異型(CC)。經χ2檢驗，病例組和對照組間該多態性位點基因型、各等位基因分布頻率之間比較差異有統計學意義(χ2=8.045，P=0.005；χ2=10.067，P=0.002)。見表2。

表2 兩組CHRNA5-rs 17486278位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.3CHRNA5-rs 17486278位點基因多態性與原發性肺癌關聯性的多因素回歸分析 以是否發生肺癌為因變量y，以基因型(CC=1、AC=2、AA=0)、基因頻率(C等位=1、A等位=0)、文化程度(≥9年=1、<9=0)、配偶情況(無=1、有=0)、吸煙年限(≥25年=1、<25=0)、每天吸煙量(≥10支=1、<10支=0)、飲酒(否=1、是=0)、合并肺部疾病(是=1、否=0)、腫瘤家族史(否=1、是=0)、職業有毒物質暴露(否=1、是=0)、應對方式(積極=1、消極=0)和營養認知行為(良好=1、一般=0)為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示吸煙年限、每天吸煙量、合并肺部疾病和營養認知行為是吸煙老年人肺癌發生的影響因素(P<0.05)；CA和CC基因型、C等位基因頻率與原發性肺癌存在一定關聯性。見表3。

表3 CHRNA5基因-rs 17486278多態性與原發性肺癌關聯性的多因素Logistic回歸分析

2.4吸煙和 CHRNA5-rs 17486278位點基因的交互作用對肺癌發生的影響 進一步應用條件Logistic回歸分析，結果顯示吸煙年限、每天吸煙量與CHRNA5-rs 17486278位點基因多態性之間聯合作用對肺癌發生的影響差異無統計學意義(P>0.05) 。見表4。

表4 兩組吸煙和CHRNA5-rs 17486278位點基因交互作用的Logistic回歸分析

調整合并肺部慢性疾病、營養認知行為

3 討 論

目前國內肺癌的發病率為每年增長26.9%，死亡率居癌癥之首〔1〕。流行病學調查顯示肺癌發病危險因素復雜，目前普遍認為吸煙是肺癌的主要危險因素，吸煙者發生肺癌的相對危險度為2.5～10.0〔6〕。本研究以吸煙老年人為研究對象，發現肺癌發生與吸煙年限和吸煙量密切相關，與目前國內外報道〔6〕相似。肺癌的發生有一定家族聚集性，有惡性腫瘤家族史者肺癌風險上升〔7〕；具有呼吸系統疾病史尤其是慢性呼吸道炎癥可引起肺部免疫功能降低和局部氣管黏膜增生和鱗狀上皮化生等病變，使肺癌風險亦有一定程度地上升〔8〕。本研究未發現腫瘤家族史與肺癌風險的關聯，可能與本組病例均為老年人，對家族疾病史認識或了解不清楚有關。本文發現良好的營養認知行為可使肺癌風險一定程度降低。合理的飲食行為可增加機體抗氧化能力、免疫能力，并有一定改善肺功能的作用，因而對肺癌的發生有一定的保護作用〔9〕。

流行病學研究顯示編碼煙堿型乙酰膽堿受體的CHRNA基因變異與肺癌發生相關，可能是肺癌發生的候選基因，例如Thorgeirsson等〔10〕在歐洲人群中發現CHRNA5基因簇上的rs 1051730、rs 8042374和rs 12914385多態性對肺癌的影響存在交互作用，但因研究的人群種族或樣本量等原因，Amos等〔11〕和Wei等〔12〕研究未得出相似的結論。本研究發現CHRNA5-rs 17486278位點基因多態與吸煙老年人肺癌有關，且CHRNA5-rs 17486278位點基因的變異與吸煙的年限和吸煙的量有關，這和李琴等〔13〕的研究結果相似，該作者通過回顧性研究發現每天吸煙量>15支者肺癌發生的風險高于不吸煙者(OR=3.49，95%CI：2.29～5.32)，且吸煙與CHRNA5-rs 17486278位點基因的變異存在交互作用。研究已證實體外煙草中的主要成分尼古丁與肺癌細胞表面的煙堿型乙酰膽堿受體結合，可調節缺氧誘導因子(HIF)-1α、促進肺癌細胞增殖、遷移、侵襲及腫瘤血管新生，同時誘導凋亡抑制基因，抑制肺癌細胞凋亡〔14，15〕。但減少煙草攝入能否抑制該位點基因突變，減少疾病的發生率，有待進一步的研究。