2型糖尿病大鼠腎組織NF-κB水平的變化

江思瑜 孫 霓 李金航 吳曉光

(承德醫學院基礎醫學院，河北 承德 067000)

糖尿病(DM)腎病(DN)具有起病隱襲、進展緩慢、高致殘致死率的特點，是發達國家慢性腎衰的首位病因〔1〕。目前已發現高血壓、血液改變、氧化應激、炎癥機制等參與了DN的形成，但對于DN發病的確切機制尚不完全清楚〔2〕。核因子(NF)-κB作為主要的轉錄因子之一，具有多向性，參與機體多種生理調節，如：細胞的增殖與凋亡、炎癥、免疫等〔3〕。本研究旨在探究NF-κB在DN形成中所扮演的作用。

1 材料與方法

1.1材料 100只健康SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，高脂高糖飼料(北京博泰宏達生物技術有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)，兔抗鼠p50單克隆抗體(Santa Cruz公司)，二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒與SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2動物建模及分組 運用隨機數字表法將100只SD大鼠分為正常組(NC組)與DM組，各50只，適應性喂養1 w。NC組飼喂正常飲食，DM組飼喂高脂高糖飲食4 w后，禁食禁水24 h，按30 mg/kg腹腔注射經緩沖液稀釋的STZ，48～72 h后，大鼠尾靜脈采血，連續3次所測空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，同時尿糖>()為模型建立成功準則，NC組則注射等量溶媒。

1.3實驗方法 分別于建模成功后的2、4、8 w，稱量大鼠體重(BW)后處死。處死大鼠前24 h開始收集代謝籠中大鼠尿液，甲苯防腐，混勻充分，300 r/min離心，取上清液檢測24 h尿蛋白(UP)、尿糖。3.5%戊巴比妥麻醉下，于大鼠股靜脈收集血液標本，300 r/min離心，取上清液分裝，全自動生化儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血清白蛋白(ALB)水平。120 mmHg高壓下，4℃生理鹽水多次漂洗腎臟至蒼白，4%多聚甲醛溶液灌注，摘取腎臟，酒精梯度脫水，石蠟包埋，制作成厚度5 μm石蠟切片。石蠟切片依次二甲苯脫蠟、酒精脫水、蘇木精染色、鹽酸乙醇漂洗、酒精脫水、伊紅乙醇復染、酒精脫水、二甲苯透明進行常規HE染色，光鏡下觀察腎臟病理變化。石蠟切片依次脫蠟、水化、微波抗原修復、滴加兔抗鼠p50單克隆抗體為一抗(1∶50稀釋)過夜、滴加二抗、鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)孵育、DAB顯色、復染、脫水、透明。高倍鏡下，隨機選取每張切片陽性細胞表達區的5個視野，統計陽性細胞表達數，取平均值。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0系統進行t檢驗、線性相關性分析。

2 結 果

2.1各組生長指標檢測結果 DM組2、4、8 w 24 h UP、FBG、BUN、SCr均較NC組顯著增高(P<0.05)，BW、血清ALB均較NC組顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組腎臟結構變化比較 HE染色下，NC組各個時期腎臟結構無明顯異常改變；DM組則均出現腎小球增大、基膜加厚、系膜擴增等病理變化，且隨病程延長，病理變化愈加明顯，在第8周，腎臟可見炎細胞浸潤。見圖1。

表1 各組生化指標檢測結果

與NC組相比:1)P<0.05

圖1 DM組腎臟改變(×400)

2.3SABC免疫組化法檢測NF-κB表達 NF-κBp50在NC組各時期大鼠腎臟中表達較少，2、4、8 w腎臟細胞有NF-κBp50表達的細胞個數分別為(1.26±0.74)、(1.58±1.23)、(1.47±1.03)個，且在胞質表達多于胞核表達；NF-κBp50在DM組各時期腎臟內均有陽性表達，并呈上升態勢，2、4、8 w腎臟細胞有NF-κBp50表達的細胞個數分別為(10.57±4.77)、(23.99±7.76)、(32.36±5.87)個，較NC組顯著增多(P<0.05)。

2.4相關性分析 NF-κBp50在腎臟中的表達與24 h尿蛋白定量呈正相關(r=0.852，P<0.05)，與BUN呈正相關(r=0.715，P<0.05)，與血清ALB呈負相關(r=-0.689，P<0.05)。

3 討 論

幾乎所有的細胞內都含有NF-κB〔4〕。NF-κB是一種調控基因表達的蛋白家族，由五個亞型組成，共同擁有Rel同源區，根據反式激活結構域(TD)的有無分為兩類〔5〕，一類有TD類：Rel(cRel)、RelB、p65(RelA，NF-κB3)；另一類無TD類：p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。二元對稱是NF-κB序列的結構特點，此特點決定了各個亞型必須發生二聚化，形成二聚體才可以發揮生物作用，最常見的二聚體是p50、p65二聚體〔6〕。當無刺激產生時，細胞處于靜止，NF-κB的二聚體與NF-κB抑制因子(IκB)在細胞質內結合，處于無活性狀態〔7〕；當受到外界刺激時，主要通過兩種方式活化NF-κB，(1)經典途徑〔6，8〕：IkBs經IkBs激酶(IKK)磷酸化自身兩個特殊絲氨酸殘基，隨后結合SCF-E3泛素化連接酶，泛素化的IkBs與NF-κB二聚體解離，對NF-κB的抑制作用喪失，NF-κB活化，進入細胞核，與特定DNA序列結合，誘導基因轉錄；(2)非經典途徑〔6，9〕：p105、p100分別是p50、p52的前體物質，除擁有p50、p52序列以外，還擁有IkB樣錨蛋白區，此區參與對相應NF-κB的抑制，前體物質轉變為p50、p52的機制尚不完全清楚，但這一過程中IKK-a和NF-κB誘導激酶所發揮的作用不可忽視。

UP、BUN、血清ALB等均可作為反映腎功能強弱的指標，推測NF-κBp50會對腎臟產生損害，并參與DN的致病。本文免疫組化結果與周誼霞等〔10〕結果相同。在李衍輝〔11〕的體外細胞培養研究中，同樣發現高糖腎系膜細胞對NF-κB表達的影響呈現濃度及時間的依賴性。高糖環境所致的代謝異常可以誘導多種信號通路轉導，刺激NF-κB激活因子生成，活化NF-κB表達〔12〕。以Toll樣受體(TLR)4信號通路為例，高糖激活TLR4，刺激髓樣細胞分化因子(MyD)88發生二聚化〔13〕，活化的TLR4結合MyD88的TIR結構域，同時MyD88的死亡結構域活化IRAK家族，IRAK1經IRAK4磷酸化后從MyD88上游離，轉向腫瘤壞死因子受體因子(TRAF)-6進行結合，TRAF-6通過磷酸化IKK，激活NB-κB〔14，15〕。本研究結果提示NF-κB與DN病程關系緊密，這可能與持續的高糖環境刺激促使NF-κB活化因子生成增加，導致NF-κB表達增多有關。但也有學者〔11〕認為是高糖環境通過對去泛素化酶CYLDN表達的抑制激活了NF-κB，NF-κB激活后刺激下游細胞黏附分子、炎性因子、趨化因子等細胞因子表達，這些因子通過不同途徑促進腎臟內皮細胞凋亡、加重炎細胞聚集、調控凝溶之間的平衡等，最終造成微血管病變，形成DN。