糖尿病大鼠心肌組織中自噬基因微管相關蛋白1輕鏈3的表達

劉曉健 陳睿琦 胡 峰 張秀冰 曾慶紅 王 藝 崔秀玲

(錦州醫科大學藥理學教研室，遼寧 錦州 121001)

自噬基因微管相關蛋白1輕鏈(LC)3是自噬的標志物，自噬形成時，胞漿型LC3(LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽，轉變為自噬體膜型(LC3-Ⅱ)。研究表明在多種疾病的發生發展與治療過程中均可有自噬水平的變化〔1,2〕。糖尿病(DM)心肌病是DM的重要并發癥。Lee等〔3〕研究表明，持續的高糖環境心肌細胞出現明顯自噬，可能促進DM心肌病的發生。而另有學者認為DM心肌中自噬不足促進了DM心肌病的發生發展，增強自噬可延緩心功能的損傷〔4,5〕。Xu等〔6〕報道心肌中自噬潮的減少是DM過程中的一種適應性反應，有自噬缺陷的DM心肌損傷反而減弱，增加自噬卻加重了DM心肌損傷。Kanamori等〔7〕報道Ⅱ型DM小鼠心肌中自噬減少，而Ⅰ型DM小鼠心肌中自噬卻增多。本研究探討DM心肌損傷過程中自噬的變化。

1 材料與方法

1.1動物及模型建立 健康雄性SD大鼠125只(購自遼寧長生生物技術有限公司，SYXK(遼)2014-0010)，8周齡，體重(245±20)g。適應性喂養1 w后，對照組(NC組)49只注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；DM模型組(DM組)86只以尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg，于注射后72 h測定空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L作為DM大鼠成模標準。造模成功72只，最終死亡8只，有1只出籠和16只因飼養過程中出現血糖回落于標準以下被剔除。飼養期間，所有動物自由飲水、進食，每周監測體重和尾靜脈血葡萄糖等情況。兩組分別在成模后第10、20、30、40、60、80、100天，以1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，結束動物飼養。

1.2心肌標本收集 麻醉狀態下迅速取出大鼠心臟，預冷的生理鹽水洗去血液，濾紙吸干水分，稱量心臟重量，計算心重指數(心臟/體重，mg/g)。分離左心室組織，取部分心肌組織快速放入-80℃冰箱凍存，待測蛋白表達。另取一部分左心室組織放入新配制的4%多聚甲醛固定液中，待進行石蠟切片的形態學檢測。

1.3心肌組織病理學檢測 取石蠟包埋切片，行普通蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察兩組各時間點心肌組織形態學改變。

1.4Western印跡檢測蛋白表達 冰上操作眼科剪刀剪碎心肌組織后，加入含有1%蛋白酶抑制劑cocktail(美國Sigma公司)的RIPA裂解液(碧云天試劑公司)，超聲碎裂組織后再在冰上裂解40 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。取上清，二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。與5倍樣品緩沖液混合后,煮沸5 min。各個樣品取等量總蛋白，經十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠中電泳后轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h后,按預染Marker標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(美國Santa Cruz公司)、LC3B抗體(美國Sigma公司)，4℃搖床孵育過夜。二抗(1∶8 000稀釋)室溫作用1 h后，電化學發光(ECL)法顯色，GIS凝膠圖像分析系統照相并分析處理。

1.5統計學處理 應用SPSS16.0軟件進行ANOVA 和LSD檢驗。

2 結 果

2.1兩組體重、FBG水平變化 DM組在造模后體重不再增加，甚至呈現明顯減少，多食、多飲，多尿、時有稀便，毛色暗淡，病程達60 d后，個別大鼠開始出現眼睛發白，80 d后，多數大鼠有明顯的眼睛白色變。NC組一切正常，毛色光亮，體格健康，無死亡，見表1。

2.2兩組不同時期心重指數比較 隨著鼠齡的增長，NC組心重指數稍有降低，而DM組明顯升高。40 d開始，與同時間點NC組相比，DM組心重指數顯著增加(P<0.01，P<0.05)，見表1。

2.3兩組心肌組織形態學變化 NC組各時間點心肌組織的HE染色，在光鏡下觀察未見顯著差別，心肌纖維走行整齊而致密。DM組在20 d時，心肌纖維走行基本整齊，與NC差別不明顯；而在40 d時，偶見心肌纖維分布較疏松，走行稍有紊亂或呈收縮狀改變；在80 d時，心肌纖維分布疏松和紊亂更為顯著，見圖1。

表1 兩組體重、FBG、心重和心重指數比較

與同時間點NC組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖1 兩組心肌組織HE染色(×400)

2.4兩組心肌組織中LC3-Ⅱ表達 NC組隨鼠齡的增加，心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達呈現增多的趨勢，10 d時1.00±0.00，20 d 1.11±0.11，30 d 1.11±0.08，40 d 1.27±0.12，60 d 1.49±0.08，80 d 1.52±0.12，100 d 1.58±0.15，從40 d開始與第10天差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。DM組隨著病程的發展，LC3-Ⅱ的蛋白表達表現為先稍增加，10 d 1.00±0.00,20 d 1.06±0.07,30 d 1.08±0.07,40 d 0.93±0.07，但差異無統計學意義(P>0.05)，而后明顯減弱，60 d 0.83±0.07,80 d 0.72±0.08,100 d 0.67±0.08(P<0.05,P<0.01)。與相同時間點NC組比較，DM組心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達在20 d時有增多趨勢(1.00±0.00 vs 1.13±0.05)，但差異無統計學意義(P=0.059 7)；40 d呈現降低趨勢(1.15±0.03 vs 1.10±

0.04)，較20 d差異有統計學意義(P<0.05)，至80 d時DM組(0.76±0.02)明顯低于NC組(1.38±0.05，P<0.01)，見圖2，圖3。

圖2 兩組不同時間點心肌組織LC3-Ⅱ蛋白表達

圖3 兩組心肌組織LC3Ⅱ的蛋白表達比較

3 討 論

據不完全統計，DM心肌病臨床發生率約75%，但其發生機制尚未完全明了。目前研究認為，早期DM心肌病發生主要是由于線粒體損傷、細胞能量代謝異常、脂毒性、鈣穩態失衡、細胞凋亡等機制參與，而氧化應激參與(DC)發生發展的各個環節〔7，8〕。

自噬過程是維持細胞合成、分解和結構重復利用必不可少的步驟。它不僅僅幫助細胞實現氨基酸的再循環，也幫助清除受損的細胞器，因而消除氧化應激，使細胞重塑而生存。LC3最初合成為未加工的形式pro-LC3，被轉化成酶處理的形式LC3-Ⅰ，最終被修改成PE共軛的形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是自噬小體結構可信賴的蛋白質標志〔9〕。

本研究結果顯示，DM組心肌組織中LC3的蛋白表達顯著減少，表明自噬水平降低，與近來較多研究結果一致〔4,6〕。本研究結果還顯示，正常的大鼠隨著鼠齡增長，心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達增多，與Xu等〔6〕報道不一致，可能與實驗動物的種類和年齡不同有關。關于自噬水平在DM心肌病變中作用的不同結論，可能與不同齡的實驗動物DM模型有關，Lee等〔3〕以幼年動物為實驗對象，結果顯示自噬促進了DM心肌病變的發展。

本研究結果提示隨著DM的病程發展，心肌組織難以維持一定水平的自噬，可能正是由于自噬的明顯減少，DM大鼠的心肌組織不能實現氨基酸的再循環及清除受損的細胞器，不能使細胞有效重塑，從而出現顯著的心肌組織損傷。