野黃芩苷對阿爾茨海默病小鼠的治療作用

田世元 邵 玉 張璐妮 張玉影 陳加俊 劉曉陽

(吉林大學中日聯誼醫院神經內三科，吉林 長春 130033)

野黃芩苷(SCU)是從黃芩莖葉、燈盞和細辛等藥物中分離得到的一種黃酮類化合物。目前，普遍認為SCU對心腦血管系統具有較好的調節功能。研究發現，SCU具有抗氧化應激〔1〕、調節鈣離子〔2〕、保護神經系統〔3〕等作用。在心肌保護方面，研究證明長期使用SCU可以抑制心肌間質纖維化，其主要途徑包括抑制纖維連接蛋白(FN)1、轉化生長因子(TGF)-β1的表達和p38-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細胞外信號調節激酶(ERK)1/2 的磷酸化，進而改善心肌梗死小鼠的心臟功能〔4〕。在促進新生血管形成方面，SCU可調節血小板內皮黏附分子、誘導基質金屬蛋白酶(MMP)-2的活化及表達，進而促進血管內皮細胞的增殖〔5〕。在神經保護方面，SCU可明顯改善缺血性腦卒中患者的臨床表現。動物實驗已證實，SCU在大鼠瞬時腦缺血時可以通過抑制聚ADP 核糖聚合酶(PARP)依賴的線粒體功能障礙和細胞凋亡誘導因子(AIF)的易位，減輕腦損傷，發揮神經保護效應〔6〕。但在行為和認知方面，有關SCU的作用還未曾報道。本文旨在成功建立阿爾茨海默病(AD)小鼠模型，探討SCU對AD小鼠學習和記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 50只小鼠由吉林大學實驗動物中心提供，均為8周齡的昆明種小鼠，雌雄各半，20～30 g。SCU購于中國食品藥品檢定所。Y-型迷宮來自三興聲電公司生產的MG-3型Y型迷宮。

1.2建立小鼠AD模型 在小鼠雙側海馬內注射寡聚態β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42，將其制成AD模型。通過對Y型迷宮的被動回避反應實驗，篩選出符合實驗要求的AD模型小鼠。

1.3實驗分組 根據體重不同隨機分為正常對照組、模型對照組(寡聚態 Aβ1～42 0.1 ml/10 g)、低劑量組(SCU 10 mg/kg)、中劑量組(SCU 20 mg/kg)、高劑量組(SCU 40 mg/kg)各10只，低、中、高劑量組分別于造模后第15天開始給予SCU，持續給藥15 d。

1.4小鼠學習能力和記憶保持的檢測 采用MG-3型Y-型迷宮行暗環境被動回避反應，MG-3型Y-型迷宮由等長(16 cm)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂和三者的交界區組成，箱底鋪設直徑0.3 cm、間距1.2 cm的鋁柵，用擋板擋住Ⅲ臂，用黑布包裹Ⅱ和Ⅲ臂形成實驗用暗室；Ⅰ臂頂端裝一盞15 W的白熾燈形成實驗用明室。將小鼠放入明室(Ⅰ臂)中，由于小鼠先天的趨暗習性，迫使其進入暗室；暗室鋁柵通電(0.3 mA、50 Hz)后，受電刺激的小鼠逃回明室，之后重復上述訓練，訓練間隔20 s，直至小鼠在明室的停留時間≥10 min，說明學會。記錄每組學會需要的訓練次數，并觀察各組學習過程的變化。最后學習達標的小鼠休息1 w，于第10天重新開始先前的測試，并記錄小鼠進入暗室前在明室停留的時間(即進洞潛伏期)，分析各組休息10 d后的記憶保持能力。

1.5統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1AD小鼠模型的測試與篩選 模型對照組學習和記憶能力明顯低于正常對照組(P< 0.01)，即AD小鼠模型建模成功。見表1。

2.2各組學習記憶能力的改變 低、中、高劑量組學會所需訓練次數均明顯少于模型對照組(P<0.01)，高劑量組與正常對照組差異有統計學意義(P<0.01)。停止訓練后，低、中、高劑量組進洞潛伏期明顯高于模型對照組(P<0.01)，但與正常對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組學會所需訓練次數及進洞潛伏期比較

與正常對照組比較:1)P<0.01

表2 各組學會所需訓練次數及進洞潛伏期比較

與模型對照組比較：1)P<0.01；2)與正常對照組比較：2)P<0.01

3 討 論

AD是一種中樞神經系統變性疾病，原發性、不可逆性、慢性進行性是其發病特點。AD的主要病理特征為患者大腦皮層和海馬區因Aβ沉積而形成大量老年斑(SP)，神經元胞體內可因tau蛋白異常聚集出現神經原纖維纏結(NFT)，此外還有神經元細胞的大量丟失，其中SP及NFT 為AD 的兩個最為典型的病理學改變〔7〕。AD主要影響患者的認知功能及學習記憶功能，認知功能、學習記憶功能是人類的高級神經功能，這些功能的減退或喪失是大腦神經元細胞衰老的重要標志。AD患者臨床上主要表現為進行性學習記憶功能損傷和認知功能障礙。關于AD的病因及發病機制迄今尚無明確定論。普遍觀點認為AD的發病與多種因素有關，如年齡、家族遺傳、代謝性因素、雌激素缺乏等。傳統觀點認為AD的發病可能與膽堿能系統功能減退、谷氨酸(GLU)能神經遞質功能障礙、免疫炎癥反應、氧自由基損傷、細胞凋亡等有關。最近研究報道從基因和分子水平對AD的發病機制進行了闡述，①tau蛋白異常學說：tau蛋白已經被證實是一種含磷糖蛋白〔8〕，也是一種微管相關蛋白(MAP)，可與微管結合并保持微管的穩定性。Weingarten等〔8〕在鈍化微管蛋白時首次分離出了這種蛋白。tau蛋白具有合成和穩定神經元細胞的作用，現代分子生物學已證實AD患者體內tan蛋白表達明顯增加，這些蛋白通常以過度磷酸化的形式存在。tau 蛋白過度磷酸化假說認為，tau 蛋白過度磷酸化在AD 發病機制的早期起重要作用〔9〕。tau 蛋白的過度磷酸化加快了tau 蛋白在大腦和腦脊液中的積累并進一步形成NFT〔9〕。此外，過度磷酸化的tau 蛋白不僅與tau、MAP1、MAP2 等微管蛋白競爭性地結合微管從而使微管解聚，微管系統瓦解，影響軸漿的運輸功能，而且使自身與微管蛋白的結合能力下降〔8,9〕。②Aβ 級聯反應學說：AD是由膜內淀粉樣前體蛋白(APP)的異常水解和錯誤折疊所致的一種淀粉樣變性疾病，Aβ42是其中的一種水解產物，也是主要的致病形式，能導致Aβ沉積，進而發展為SP〔10,11〕。研究顯示，Aβ抑制腦中大分子量蛋白酶的活性，導致Aβ無法降解，這樣就進入了一個Aβ聚積的惡性循環〔12〕。此外，在AD患者中，Aβ的異常沉積形成免疫原，導致小膠質細胞和星形膠質細胞被激活，補充和釋放炎性因子，通過直接或間接慢性免疫反應的作用，造成神經元損害〔13〕。③基因突變學說：AD患者基因突變通常位于21號染色體、14號染色體和1號染色體上，目前已經報道過的基因突變包括APP基因、載脂蛋白(Apo)E基因、早老素1基因和早老素2基因，其他可能導致AD的基因位點存在于9、10、12和19號染色體上〔14〕。目前被大多數學者所接受的是Aβ 級聯反應學說，即Aβ在大腦內特定區域聚集，進而引發神經元凋亡、NFT、氧化應激及膽堿能系統損傷等一系列病理變化，這些病理性改變在AD的進程中發揮重要作用〔15,16〕。

目前治療AD的藥物種類繁多，但主要有以下兩大類：膽堿酯酶抑制劑(如：多奈哌齊，加蘭他敏和利伐斯的明)和非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(美金剛)，這些藥物雖然有助于AD患者認知功能的改善，但不能阻止進行性神經變性〔17,18〕。此外，上述藥物均存在輕-中度的副作用，如多奈哌齊的主要不良反應有惡心、嘔吐、腹瀉、頭暈、失眠、肌肉痙攣等；美金剛片的常見不良反應有幻覺、意識模糊、頭痛、頭暈、疲倦等。SCU藥理作用研究主要集中在其對心血管系統的調節功能。它具有對抗氧化應激的作用，可以減輕PC12細胞由氧化應激反應而引起的細胞凋亡〔1〕。SCU也具有抗心肌肥厚的藥理作用，可以通過調控鈣調蛋白激酶(CaMK)Ⅱ信號通路和鈣調神經磷酸酶介導Ca2+來發揮抗心肌肥厚〔2〕。SCU還可通過抑制小膠質細胞的炎癥反應而起到神經保護作用〔3〕。有學者證實，SCU在體外可以抑制Aβ聚集，進而防止了由Aβ介導的細胞凋亡〔19〕。另外，SCU還可能通過G蛋白耦聯受體(GPR)30介導的非基因組信號傳導途徑來預防Aβ誘導的神經元損傷〔20～22〕。一些SCU具有較強的抗氧化活性，但抗Aβ聚集和(或)抗Aβ誘導的細胞凋亡沒有明顯效果〔23〕。據世界衛生組織預測，到21世紀中期，全球將有1.07億人患AD〔24〕。本研究結果提示SCU可以明顯提高小鼠的學習能力和短期記憶能力，揭示了SCU對神經的保護作用，從而為藥物治療AD提供了新的思路和方法。