N-乙酰半胱氨酸對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥反應的抑制作用

彭曉東 冼 倩 楊春蘭 龐浩文

(廣東醫科大學附屬醫院急診科，廣東 湛江 524001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種氣流受阻且不可逆的慢性炎癥疾病，目前研究發現炎癥、氧化系統失衡、蛋白酶系統失衡是COPD發生的可能機制〔1〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一種臨床上廣泛使用的黏液溶解劑，目前可被用來治療COPD，使患者痰黏液癥狀緩解，第1秒用力呼氣量(FEV1)及50%肺活量時的呼氣流速(MEF50)改善，但主要機制是通過提高機體抗氧化能力，降低氧化產物實現的〔2～4〕，而對于NAC是否能夠通過抑制炎癥反應來減輕COPD報道較少，本研究旨在探討NAC對COPD大鼠炎癥反應的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 50只約4周齡(200±20)g的SD雄性大鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證書：SCXK(滬)2012-0002，大鼠自由飲食和攝水。

1.2主要試劑及儀器 NAC購自美國Sigma公司，批號p12036；脂多糖(LPS)購自北京索萊寶生物技術有限公司；兔抗核轉錄因子(NF)-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自美國Abcam公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細胞介素(IL)-1β，IL-6，IL-8，基質金屬蛋白酶(MMP)-2，MMP-9酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。ChemiDocTMXRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司；ELX800酶標分析儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3建模及分組 50只大鼠隨機分為正常組，模型組，NAC低、中、高劑量組，每組10只。其中模型組及NAC采用煙熏+氣管內滴加LPS復制COPD大鼠模型，具體操作參考相關文獻〔5〕：兩組大鼠置于已制作好的玻璃煙熏箱內，每天2次，每次30 min，每次間隔時間6 h，連續28 d，向煙熏箱內注入香煙煙霧。同時在第1、14天麻醉大鼠，沿著氣管一次性緩慢注入200 μg/ml LPS，體積200 μl。正常組照常飼養。每天煙熏前30 min，NAC組分別灌胃給予50、100、200 kg·mg-1·d-1NAC，正常組及模型組給予等量生理鹽水，連續28 d。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)及標本的獲得 第28天，用磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗大鼠左肺支氣管肺泡，離心灌洗液并重懸，部分灌洗液用于血細胞分析儀測量總白細胞數，部分灌洗液經涂片后，用Kwik-Diff染色法對中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞進行計數。另外將右肺組織取下并剔除脂肪組織清洗干凈，用于細胞因子及蛋白的檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 將右肺組織標本固定24 h后，石蠟進行包埋，切片后，于二甲苯、梯度酒精、蒸餾水中脫蠟至水洗。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，流水沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，于鏡下觀察。

1.6ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-2及MMP-9含量 取部分右肺組織，勻漿離心后，加入胰蛋白酶裂解，1 500 r/min離心10 min，收集上清液，后取上清液嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.7Western印跡檢測NF-κB 信號通路相關蛋白表達 取肺組織標本，加入細胞裂解液裂解，離心收集上清液即總蛋白，并測定蛋白濃度。制作5%濃縮膠，12%分離膠，室溫水封靜置30 min。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉膜。一抗溶液(兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗體，稀釋度均為1∶100)孵育，4℃過夜；次日于二抗溶液室溫孵育1 h。于凝膠成像系統中曝光。

1.8統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1NAC對COPD大鼠肺組織病理形態的影響 正常組肺組織結構完整，肺泡清晰完整，無炎性細胞浸潤；模型組肺泡結構破壞，大量炎性細胞浸潤；NAC組特別是高劑量組肺泡結構較為完整，炎性細胞浸潤浸潤較少。見圖1。

圖1 各組肺組織病理形態(HE，×200)

2.2NAC對COPD大鼠BALF中各類細胞數目的影響 與正常組比較，模型組中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞數及白細胞總數均顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，NAC低、中、高劑量組均顯著下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組BALF中各類細胞數目比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01;下表同

2.3NAC對COPD大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8含量的影響 與正常組比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，NAC低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺組織TNF-α，IL-1β，IL-6及IL-8含量比較

2.4NAC對COPD大鼠肺組織中MMP-2及MMP-9含量的影響 與正常組比較，模型組MMP-2及MMP-9含量均顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，NAC低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.01)。見表3。

2.5NAC對COPD大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組p-IκBα及p-NF-κB p65表達顯著上調(P<0.01)；與模型組比較，NAC低、中、高劑量組p-IκBα表達顯著下調(P<0.01)，NAC中、高劑量組p-NF-κB p65表達顯著下調(均P<0.01)。見圖2，表3。

A～E：正常組、模型組、NAC低、中、高劑量組圖2 NAC對COPD大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

組別MMP-2(ng/ml)MMP-9(ng/ml)p-IκBα/IκBαp-NF-κB p65/NF-κB p65正常組0.18±0.020.35±0.030.08±0.010.06±0.00模型組7.53±0.751)8.42±0.841)0.57±0.061)0.38±0.041)NAC低劑量組5.64±0.562)6.13±0.612)0.32±0.032)0.38±0.04NAC中劑量組3.28±0.332)4.72±0.472)0.20±0.022)0.25±0.022)NAC高劑量組1.71±0.172)2.45±0.242)0.11±0.012)0.17±0.022)

3 討 論

NAC是一種含有巰基的半胱氨酸衍生物，能夠通過降解酸性蛋白多肽的二硫鍵，進而分解黏蛋白，最終降低痰的黏性，因此被應用于各種原因導致的肝損傷、肺損傷、重金屬重度、心血管等的治療〔2～4〕。反復煙熏聯合2次氣管滴入LPS是目前構建COPD大鼠模型最為常用的方法〔5〕，HE染色結果表明模型大鼠肺泡結構破壞嚴重，大量炎癥因子浸潤，說明造模成功。本研究結果表明NAC能顯著改善COPD大鼠肺組織形態，減少炎癥細胞浸潤及 BALF中炎性細胞數目，提示NAC可能通過抗感染作用抑制COPD大鼠炎癥反應。

在COPD過程中單核-巨噬細胞產生大量的TNF-α，IL-1β、IL-6及IL-8加重炎癥反應〔6〕。且COPD過程中炎性細胞釋放大量的MMPs，MMPs降解肺細胞外基質，使細胞壁變薄，黏液分泌增多，還破壞肺泡結構，使肺泡腔擴大，進而加重了COPD〔7〕。因此降低炎癥因子水平及MMPs含量能一定程度上緩解COPD。另外NF-κB信號通路是一類能夠與特異性κB位點結合的NF，在機體炎癥反應過程中起重要作用〔8〕。生理條件下，NF-κB p65亞基位于細胞質，與IκB位點結合形成三聚體，不具有轉錄活性。在受到LPS等外界信號刺激時，IκB位點被降解、磷酸化、三聚體解離，p65進入細胞核，進而調控相關基因表達，而且研究顯示NF-κB在COPD中活性顯著上升，且NAC對NF-κB p65活性具有抑制作用〔9〕。綜上，NAC能顯著改善COPD大鼠肺組織形態，減少炎癥細胞數目，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-2，MMP-9含量，可能與阻斷NF-κB信號通路有關。