結核感染T細胞斑點試驗在糖尿病并發肺結核診斷中的價值

王雅 吳妹英 楊坤云 阿爾泰 吳樹才 耿書軍 李志惠 李明武 康萬里 唐神結

我國是全球結核病30個高負擔國家之一[1]，同時也是糖尿病高發國家[2]。糖尿病患者由于糖、脂肪、蛋白質等代謝障礙使其成為結核病的易感人群，而活動性結核病作為一個感染因素又可加重糖尿病、誘發酮癥酸中毒等并發癥[3]。由于糖尿病并發肺結核患者免疫力低下、早期臨床癥狀和影像學表現不典型等，使傳統的診斷方法存在一定的局限性。因此，早期快速診斷技術在糖尿病并發肺結核中的應用可提高診斷陽性率，是改善糖尿病并發肺結核患者預后、控制結核病傳播的重要措施。

結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是基于γ干擾素(IFN-γ)釋放試驗原理，在酶聯免疫斑點技術(enzyme-linked immunos-potassay, ELISPOT)的基礎上，應用細胞免疫反應建立起來的檢測單細胞水平分泌抗體或細胞因子的新型體外免疫檢測法。T-SPOT.TB在潛伏結核感染和活動性肺結核的診斷上具有較高的敏感度和特異度，但大部分研究都是基于結核病低負擔國家得出的結論[4-7]，其在結核病高負擔國家中的診斷應用還缺乏充足的證據。目前，T-SPOT.TB已被諸多歐美國家的臨床診療指南推薦用于結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)培養陰性肺結核、涂片陰性肺結核及肺外結核等的臨床輔助診斷方法[8]。然而，其對糖尿病并發肺結核患者進行診斷的相關研究鮮見報道。筆者探討T-SPOT.TB檢測技術在并發糖尿病的肺結核患者診斷中的應用價值。

資料和方法

一、對象及診斷標準

1.研究對象：對2012年12月至2015年11月在北京胸科醫院、蘇州市第五人民醫院、湖南省胸科醫院、新疆維吾爾自治區胸科醫院、河北省胸科醫院、昆明市第三人民醫院結核科住院的302例糖尿病并發肺結核及單純糖尿病患者進行回顧性分析。207例為糖尿病并發肺結核患者，其中糖尿病并發培養陽性肺結核141例(簡稱“Ⅰ組”)，糖尿病并發培養陰性肺結核(包括痰涂片陽性和痰涂片陰性患者)66例(簡稱“Ⅱ組”)；95例為單純糖尿病患者(簡稱“Ⅲ組”)。 所有患者均接受了有效的T-SPOT.TB檢測，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體檢測均為陰性。所有患者均無免疫系統疾病、未接受免疫抑制劑治療，并均排除惡性腫瘤。

本研究302例調查對象中，男性240例(79.5%)，女性62例(20.5%)。Ⅰ組141例(46.7%)，Ⅱ組66例(21.8%)，Ⅲ組95例(31.5%)。三組患者年齡(χ2=24.39，P<0.001)、體質量指數(BMI)(χ2=11.07，P=0.004)、卡介苗接種情況(χ2=11.70，P=0.003)比較差異均有統計學意義，而性別、吸煙和飲酒等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2. 診斷標準：肺結核診斷符合中華人民共和國衛生部制定的《WS 288-2008肺結核診斷標準》[9]。培養陰性肺結核的診斷標準：(1)典型肺結核的臨床癥狀和胸部X攝影表現；(2)抗結核藥物治療有效；(3)臨床可排除其他非結核性肺部疾?。?4)痰結核分枝桿菌培養陰性。

2型糖尿病的診斷參照文獻[10]，即有明顯的糖尿病典型癥狀(包括多飲、多食、多尿、體質量下降)，并滿足以下任意一個條件：(1)任意時間血糖≥11.1 mmol/L；(2)空腹血糖≥7.0 mmol/L；(3)空腹血糖≥7.0 mmol/L且口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)2 h血糖≥11.1 mmol/L。

二、實驗方法

全血T-SPOT.TB 檢測試劑盒由英國 Oxford Immunote公司生產。采集肝素鋰抗凝患者外周血5 ml，室溫保存，按操作程序分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，稀釋成2.5×106/ml 的工作液，在已預先包被IFN-γ抗體的微孔板中分別加入細胞培養液作為陰性對照，植物血凝素(PHA)作為陽性對照；早期分泌性靶抗原6(early secretory antigenic target 6，ESAT-6) 作為抗原A，培養分泌蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)作為抗原B，各50 μl加入檢測孔，然后再在各孔中加入100 μl已配好的單個核細胞工作液，37 ℃ 5% CO2培養 16～20 h；洗板后加入酶標記鼠抗人IFN-γ單克隆抗體，2～8 ℃孵育1 h，洗板后加底物顯色，根據試劑說明書進行閱讀并統計。

表1 不同人口學特征在三組患者中的分布情況

T-SPOT.TB 結果判定：當陰性對照孔斑點數為0～5個且測試孔斑點數減去陰性對照孔斑點數≥6個，或陰性對照孔斑點數6～10個且測試孔斑點數≥2倍的陰性孔對照數為陽性，陽性對照孔斑點數>20個視為實驗有效，陰性對照孔斑點數>10個視為結果無法判讀，必須重新檢測，如陽性對照正常而檢測孔斑點數達不到陽性標準則判為陰性[11]。

三、相關公式

敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%;特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；準確度=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%。

四、統計學處理

用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計數資料采用率值(%)進行統計學描述，組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗。定量資料的統計描述根據資料分布特征采用“均數±標準差”或中位數、四分位數表示。多組定量資料的組間比較根據資料分布特征采用單因素方差分析或秩和檢驗(Kruskal-Wallis)。糖尿病并發肺結核T-SPOT.TB 陽性結果的影響因素分析，單因素分析采用卡方檢驗，如果單因素分析差異有統計學意義，再進行logistic 回歸多因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、糖尿病并發肺結核患者的臨床特征

Ⅰ組咳嗽、咳痰、盜汗、體質量減輕的比率均高于Ⅱ組患者，差異有統計學意義(P值均<0.05)。Ⅰ組患者抗酸桿菌的檢出率高于Ⅱ組，差異有統計學意義(χ2=103.96，P<0.01)。結核病變范圍相比較，Ⅰ組較Ⅱ組患者分布范圍更廣泛，差異有統計學意義(χ2=12.58，P<0.01)。結核空洞及其范圍相比較，Ⅰ組較Ⅱ組患者分布范圍更廣泛，差異有統計學意義(χ2=10.71，P=0.003)，見表2。

二、T-SPOT.TB檢測的陽性率

T-SPOT.TB檢測的陽性率在Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別為92.9% (131/141)(95%CI：87.3%～96.5%)、86.4% (57/66)(95%CI：75.7%～93.6%)、48.4% (46/95)(95%CI：38.0%～58.9%)。Ⅰ組的T-SPOT.TB檢測陽性率明顯高于Ⅲ組，差異有統計學意義(χ2=59.91，P<0.01)；Ⅱ組的T-SPOT.TB檢測陽性率明顯高于Ⅲ組，差異有統計學意義(χ2=24.33，P<0.01)；Ⅰ組與Ⅱ組的T-SPOT.TB檢測陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=2.31，P=0.129)。

表2 不同臨床特征在兩組糖尿病并發肺結核患者中的分布

注 表中括號外數值為“患者例數”，括號內數值為“比率(%)”

三、T-SPOT.TB檢測的診斷效能

以臨床診斷為金標準,T-SPOT.TB檢測診斷糖尿病并發肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷準確度分別為90.8%(188/207) (95%CI：86.0%～94.3%)、51.6%(49/95) (95%CI：41.1%～62.0%)、80.3%(188/234) (95%CI：74.7%～85.2%)、72.1%(49/68) (95%CI：59.9%～82.3%)、78.5%(237/302) (95%CI：73.4%～83.0%)。

四、糖尿病并發肺結核患者T-SPOT.TB檢測陽性的相關因素分析

T-SPOT.TB 陽性結果與年齡、性別、BMI、痰菌、影像學表現、并發癥等因素均沒有相關性(P值均>0.05)(表3)。

討 論

糖尿病是并發結核病的相關疾病之一，隨著全球糖尿病發病例數的升高，糖尿病并發肺結核患者的比例也在不斷上升[12]。持續高血糖可導致機體蛋白質及脂肪代謝紊亂，引發營養不良，并且可影響白細胞吞噬能力；而組織內含糖量高，以及引起的血高丙酮酸水平有利于MTB生長繁殖，增加結核易感性[13]。糖尿病導致的微血管病變可累及肺部，使肺部通氣-血流比例失衡，氧分壓增高，損傷氣道黏膜，利于MTB在肺部的定植[14-15]；糖尿病還可進一步影響抗結核藥物的療效和結核病患者的預后[14,16]。

表3 各類相關因素對糖尿病并發肺結核患者T-SPOT.TB 檢測陽性的影響

注a：采用Fisher精確概率法

而結核病患者出現的發熱等中毒癥狀可反過來加重糖尿病患者的代謝紊亂，誘發酮癥酸中毒。一些抗結核藥物也可干擾糖代謝，加重糖尿病的并發癥[17]。糖尿病并發肺結核患者與單純肺結核相比，臨床表現多樣化，病情進展迅速，病變范圍廣，干酪病灶多，病死率和復發率高，屬難治性肺結核范疇。所以準確、快速地診斷糖尿病并發肺結核具有非常重要的臨床意義，是改善糖尿病并發肺結核患者預后、控制結核病傳播的重要途徑[16]。

目前，結核病的診斷主要依靠臨床癥狀、影像學、痰涂片、痰分枝桿菌培養和結核菌素皮膚試驗(TST)等，糖尿病并發肺結核患者臨床癥狀及影像學表現往往不典型，痰涂片陽性率和特異度相對較低，臨床上易造成漏診和誤診[13]。MTB培養陽性是結核病診斷的金標準，但分枝桿菌培養耗時長，培養條件嚴格，且痰液樣本質量的不確定性將嚴重影響其診斷敏感度[18]。而傳統TST與卡介苗存在交叉反應，會出現較高的假陽性，且敏感度受到患者細胞免疫功能的影響，在糖尿病患者人群中的敏感度不高，其診斷的實際應用價值十分有限[19]。

T-SPOT.TB是以ELISPOT試驗原理為基礎發展而來，基于MTB的RD1區編碼的ESAT-6和CFP-10刺激PBMC中的結核特異性T細胞分泌IFN-γ與否來判定是否為結核感染，因此與卡介苗和非結核分枝桿菌無交叉免疫反應。目前，T-SPOT.TB已被諸多發達國家的臨床診療指南推薦用于結核感染的臨床診斷[8]。但在大多數的發展中國家，例如中國，T-SPOT.TB試驗不能用于確診或排除活動性結核病，但對缺少細菌學診斷依據的活動性結核病(如菌陰肺結核等)，T-SPOT.TB可在常規診斷依據的基礎上，起到補充或輔助診斷的作用[20]。這是由于我國潛伏結核感染患者的比例較大，T-SPOT.TB試驗雖然對于潛伏結核感染及活動性肺結核的診斷具有較高的敏感度和特異度[21-22]，但存在一定的假陰性率；加上該檢查技術的敏感度和特異度差異較大，同時無法區分潛伏結核感染和活動性結核病。然而，仍然有很多研究人員建議在結核病高負擔國家中使用T-SPOT.TB試驗作為結核病的輔助診斷方法[23-25]。另有部分研究推薦其作為疑似結核病患者的納入或排除檢查，在結核病高負擔國家中有預防控制結核病傳播與流行的價值[26]。

關于T-SPOT.TB在結核病人群中的診斷國內外已有諸多研究，但用于診斷糖尿病并發肺結核患者的研究報道甚少。以往的研究認為，T-SPOT.TB試驗受機體免疫狀態影響較大，對免疫調節受損的人群診斷敏感度較低；糖尿病患者機體免疫功能低下，T細胞數低于正常人，免疫功能受到影響，IFN-γ的分泌量應該較免疫功能正常者減少[13]，因此T-SPOT.TB的檢測效果可能會受到影響。但Stalenhoef等[27]研究證實，這部分下降的IFN-γ是體內非特異性的IFN-γ，特異性的、由ESAT-6和CFP-10所激發的IFN-γ的分泌水平并不會降低。而免疫抑制狀態對于T-SPOT.TB檢測結果的影響是存在的，但其影響在極其嚴重的患者中才比較明顯[28]。本文為多中心研究，納入了207例糖尿病并發肺結核患者和95例單純糖尿病患者，以探討T-SPOT.TB檢測在糖尿病并發肺結核患者診斷中的應用價值。結果顯示，Ⅰ組患者T-SPOT.TB檢測陽性率為92.9%，明顯高于Ⅲ組(48.4%)；Ⅱ組患者T-SPOT.TB檢測陽性率為86.4%，明顯高于Ⅲ組(48.4%)。以上研究結果表明，T-SPOT.TB檢測在糖尿病并發肺結核患者的診斷中具有重要價值。Walsh等[29]的研究也發現，T-SPOT.TB檢測在結核病人群中的敏感度為93%，且診斷效能不受糖尿病因素的影響。Syed等[30]認為，IFN-γ的釋放水平與糖尿病狀態并無相關性，甚至并發糖尿病的患者對抗原刺激的反應性要強于單純結核病患者；IFN-γ釋放試驗在檢測糖尿病并發肺結核患者的敏感度不低于單純肺結核患者，分析其原因可能是糖尿病并發肺結核患者機體的細菌負擔更重，可促進體內的免疫刺激加強[31]。然而在筆者的研究中，Ⅰ組患者存在7.1%(10/141)的T-SPOT.TB陰性率。有多種因素可以影響T-SPOT.TB檢測的陽性率，包括并發HIV感染、免疫抑制、高齡、惡病質、營養不良、肺外結核、吸煙、MTB菌株差異等[32-33]。Kim 等[34]的研究發現，T-SPOT.TB 檢測的假陽性結果還可能與既往存在結核感染相關。本次研究在分枝桿菌培陽患者中產生的T-SPOT.TB檢測陰性結果，可能與部分入選患者的高齡、營養狀況差、并發癥較多有關。此外，Lee 等[35]研究認為，結核性腦膜炎可能是T-SPOT.TB檢測假陰性的危險因素；但本研究并未對302例調查對象是否并發結核性腦膜炎的情況進行分析，只能猜測其可能是造成糖尿病并發肺結核患者培養陽性組有10例T-SPOT.TB檢測陰性的原因，有待進一步驗證。

本次研究結果顯示， T-SPOT.TB檢測在糖尿病并發肺結核患者中診斷的敏感度為90.8%，另一項關于T-SPOT.TB檢測在糖尿病并發活動性肺結核患者中的研究顯示，其敏感度為96.67%[36]。薈萃分析結果顯示，T-SPOT.TB檢測在我國整體肺結核患者中的敏感度約為88%[37]。Zhang等[38]的研究顯示，T-SPOT.TB檢測在我國活動性肺結核患者中診斷的敏感度為94.7%；而美國-墨西哥的一項聯合研究表明，其在結核病患者中的敏感度為93%[29]?？梢?，T-SPOT.TB檢測對糖尿病并發肺結核患者的敏感度并未下降。分析其原因，可能與T-SPOT.TB技術以對MTB特異性抗原起反應的效應性T淋巴細胞為檢測目標，而非檢測機體的免疫反應強度。本研究中，T-SPOT.TB檢測的特異度較低(51.6%)，其在單純糖尿病組中的陽性率為48.4%；而T-SPOT.TB檢測在結核病低流行國家診斷活動性肺結核時具有較高的特異度(≥93%)[39]，在結核病高負擔國家中特異度較低(≤61%)[40-41]。而在本研究中，單純糖尿病患者T-SPOT.TB檢測的陽性率為48.4%，陽性率如此之高，推測這可能是由于我國潛伏結核感染患者比例較高，而糖尿病又是結核病的易感因素，糖尿病患者中潛伏結核感染者更多。當然，這也表明了T-SPOT.TB檢測在診斷上存在局限性和不足，在結核病高負擔國家的臨床實踐中應慎重評價其檢測結果。

筆者在分析影響糖尿病并發肺結核患者T-SPOT.TB檢測陽性結果的相關影響因素時發現，T-SPOT.TB檢測陽性結果與年齡、性別、BMI、痰菌檢測結果、影像學表現、并發癥情況等因素均沒有相關性(P值均>0.05)。高衛衛等[42]在菌陽肺結核的研究中發現，患者的年齡、性別、基礎疾病及繼發性疾病(結核性胸膜炎、藥物性肝損傷、低蛋白血癥、白細胞減低癥及并發肺外結核)均不影響患者T-SPOT.TB檢測的陽性率，該結果與目前研究報道的結果相一致[43-44]。僅Leow等[45]認為T-SPOT.TB檢測與年齡相關，特別是>60歲的患者，但該研究納入的樣本同其他研究相比，存在種族差異。筆者的研究提示，在糖尿病并發肺結核患者中，無論是痰菌陽性還是陰性、是否有空洞、病灶范圍大小、并發癥情況等均不影響T-SPOT.TB檢測的結果，即使是早期輕癥肺結核患者，T-SPOT.TB檢測仍然可以呈現陽性結果。這一結果表明，T-SPOT.TB檢測可以用于糖尿病并發肺結核患者的早期快速診斷。

本研究的不足之處：本組入選患者的年齡、BMI、卡介苗接種情況存在差異性，可能會對結果產生一定的影響。此外，在實驗分組設計時沒有設單純肺結核患者組，沒有設健康對照組也是本研究的缺陷之一。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測診斷糖尿病并發肺結核具有較高的陽性率，同時也具有良好的敏感度和準確度，受其他因素干擾小，可以作為肺結核并發糖尿病的一種輔助診斷方法。