食品中霉菌、酵母菌檢驗能力驗證的影響因素探討

◎ 覃 曉，羅秋敏，王 玲

（桂林市食品藥品檢驗所，廣西 桂林 541002）

食品中微生物能力驗證是檢驗實驗室檢驗技術水平的重要手段，確定實驗室進行某些特定的檢測能力，以考察實驗室檢測能力的外部質量活動，增加客戶對實驗室的信任，提高實驗室的知名度[1]，也是實驗室內部質量控制的一種方法補充。對于食品中微生物限量的檢驗霉菌、酵母菌的檢驗計數是最常規的指標。雖然霉菌、酵母菌的檢驗方法看似簡單，但由于食品種類繁多、成分復雜，受污染程度不同，加上霉菌、酵母種類多樣，它們對環境的溫濕度及營養成分的要求不同，要想在同一條件下培養出各種霉菌和酵母也實屬不易[2]。

為了提高檢驗結果的準確性，本實驗室在參加食品中微生物能力驗證的過程中采用幾種檢驗方法同步試驗，找出了影響計數結果的因素，經綜合分析，取得了滿意的結果。

1 實驗材料

1.1 樣品

能力驗證樣品1（17-T019）、能力驗證樣品2（17-Q357），均為中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供。

1.2 菌種、培養基及稀釋液

黑曲霉（Aspergillus niger，ATCC 16404）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，ATCC 9763），均購自廣東省微生物菌種保藏中心。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、孟加拉紅瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）、沙氏瓊脂（SDA，含氯霉素）、生理鹽水，生產廠家均為北京陸橋技術有限責任公司。

1.3 儀器及材料

生物安全柜、生化培養箱、高壓滅菌鍋、移液槍（1～5 mL）、滅菌槍頭（1 mL）、滅菌刻度吸管（1 mL）、一次性塑料平皿。

2 試驗方法及結果

2.1 樣品處理

按能力驗證操作規程指南，樣品用40 mL稀釋液水化。取樣品1、樣品2置于室溫，分別開啟樣品，立即加入10 mL稀釋液進行溶解，吸出放入無菌瓶中，再反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，搖勻，作為樣品原液。再按無菌操作以10倍梯度作不同程度的稀釋。（※本次凍干的能力驗證樣品等同于40.0 mL的食品樣品。）

2.2 檢驗方法

2.2.1 不同培養基

分別吸取不同稀釋級別的17-T019及17-Q357樣品試液1 mL注皿，平行2份，分別傾注冷卻至約45 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、沙氏瓊脂（含氯霉素）各約18 mL，搖勻，靜置冷卻，28 ℃正置培養。結果見表1。

表1 不同培養基比較表

2.2.2 不同人員操作

兩人分別取兩份樣品17-T019及17-Q357的原液，用移液槍按無菌操作各自稀釋成不同濃度的供試液，吸取1 mL注皿，平行2份，分別傾注約45 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），搖勻，靜置冷卻。以28 ℃正置培養觀察。結果見表2。

2.2.3 不同吸注器

分別用刻度吸管和移液槍對樣品17-T019及17-Q357的原液按無菌操作進行不同濃度的稀釋，取1 mL注皿，平行2份，分別傾注約45 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），搖勻，靜置冷卻。以28 ℃正置培養觀察，結果見表2。

表2 同一種培養基不同人員操作及不同吸注器比較表

2.2.3 不同培養時間

對樣品17-T019及17-Q357的4種培養基平皿不同時間段進行觀察計數，發現培養24 h，4種培養基肉眼觀察無菌落生長，培養36 h有少量霉菌菌絲，培養48 h霉菌和酵母菌生長已經達到峰值，培養60 h霉菌和酵母無明顯增殖現象，霉菌菌絲已影響平皿的觀察，培養72 h霉菌已產生孢子，并且菌絲已覆蓋整個平皿，造成霉菌和酵母菌計數困難。

2.3 重復驗證試驗

取兩份樣品原液和本實驗室里黑曲霉和啤酒酵母兩個陽性菌分別用上述培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基進行重復實驗。結果對于能力驗證的兩份樣品重現性較好，玫瑰紅鈉瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂對能力驗證樣品檢測結果均高于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基及沙氏瓊脂（含氯霉素），上述5種培養基對于本實驗室的兩個陽性菌，檢測結果存在一定規律性，因此，檢測食品中霉菌、酵母所用培養基和檢測藥品中霉菌、酵母所用培養基由于所含成份有所不同，檢測結果存在差異。結果見表3。

表3 重復驗證試驗表

上接表3

3 結果與討論

從不同培養基比較看，雖然上述5種培養基都是檢測霉菌、酵母菌，但由于各培養基所含組分及營養成分含量的不同，檢測結果出入較大。特別是檢測食品的培養基與檢測藥品的培養基不能混用，必須嚴格按標準操作，不然檢測結果將會帶入偏高或偏低的風險，影響最終判斷。

對于本次的驗證樣品所用培養基含抗生素和不含抗生素組份檢測結果存在明顯差異，特別是酵母菌計數。從陽性菌啤酒酵母的計數看，含抗生素成分的比不含抗生素成分的培養基計數結果要低25%～30%。因此，正確選用培養基很重要。經綜合分析，選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）的檢測數據上報，結果評價為滿意。

不同人員操作和不同吸注器對計數結果影響甚微，操作中注意搖勻樣液，平行多注1～2個皿就能消除操作中的誤差。

在不同培養時間觀察過程中，建議在培養40～48 h計數較為準確。培養48 h后霉菌菌絲影響觀察和計數。