酶比色法測定乳粉中的膽堿含量

◎ 黃高琳

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

膽堿又稱維生素B4，是一種強有機堿，分子結構式為HOCH2CH2N+(CH3)3，在酸堿條件下均不穩(wěn)定，但對熱穩(wěn)定。膽堿在動物的正常生長和發(fā)育過程中非常重要，對促進神經(jīng)發(fā)育有極其重要的作用。膽堿在食物中的存在形式為游離和酯化膽堿，如磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿、磷脂酰膽堿和神經(jīng)鞘磷脂。作為營養(yǎng)強化劑，膽堿可以促進嬰幼兒大腦發(fā)育，因此出生后攝入足量的膽堿對嬰兒發(fā)育至關重要。膽堿的添加含量具有一定的限制，因此開展乳粉中膽堿的測定非常重要[1-2]。

嬰幼兒乳粉中膽堿的測定方法有酶比色法、雷氏鹽比色法、離子色譜法等，每種檢測方法都存在一定的優(yōu)點和缺點。酶比色法操作簡便、重復性好、檢出限低、對試驗人員安全，但酶價格較高。雷氏鹽比色法操作繁瑣、試劑有一定毒性，但成本較低。離子色譜法檢出限低、回收率高、精密度好，但是設備購買維護成本高。本文采用法酶比色法對市售嬰幼兒乳粉進行檢測，并做出研究與探討[3]。

1 試驗儀器與試劑

試劑：99.5%酒石酸氫膽堿、過氧化物酶（美國SIGMA）、膽堿氧化酶（美國SIGMA）、磷脂酶（美國SIGMA）、4-氨基安替吡啉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉和苯酚。除特殊指明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水。

儀器：紫外可見分光光度計（島津UV2550）、電子天平（Mettler Toledo ML204/02）、電熱恒溫水浴鍋（HWS-26）和pH計（雷磁PHSJ-3F）。

2 實驗方法

2.1 樣品處理

稱取5 g左右乳粉試樣于50 mL的離心管中，加入1 mol/L的鹽酸30 mL，擰緊蓋子，渦旋1～2 min使奶粉充分溶解。置于70 ℃的水中水解3 h，取出冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值在3.5～4.0，用水定容至50 mL后混勻，過濾，靜置。

2.2 顯色與測定

分別取250 μg/mL膽堿標準使用溶液2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶，用水定容至刻度，配制成50、100、150、200 μg/mL的標準工作液。各取0.100 mL標準工作液、0.100 mL水于25 mL比色管，加入3 mL發(fā)色劑。

另取兩個試管（A和B），分別加入0.100 mL的樣品濾液，將3.00 mL的蒸餾水加入試管A之中，將3.00 mL的發(fā)色劑加入試管B之中。用塑封保護膜將兩個試管蓋住，混勻，放入37 ℃的水中保溫15 min，取出待其冷卻至室溫后在波長505 nm處測其吸光度，同時蒸餾水做空白。以膽堿濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為A=0.003 2x-0.010 5，相關系數(shù)R2=0.999 1，線性良好。

圖1 乳粉中膽堿的標準曲線圖

3 結果與討論

3.1 回收率與精密度

本方法操作簡便、精確、檢出限為1 mg/100 g。取羊奶粉5 g三份，分別加入2.5、5、7.5 mg，重復試驗3次，膽堿回收率為95.3%～106.1%。同一種樣品取樣6次，分別測膽堿，精密度為1.28%

表1 膽堿精密度表

3.2 市售國產(chǎn)奶粉中膽堿

2017年4月—2017年9月隨機采購市面上流通的40種品牌88批次的國產(chǎn)嬰幼兒奶粉，進行膽堿含量的分析檢測。依據(jù)GB 10765-2010《嬰兒配方食品》和GB 10767-2010《較大嬰兒和幼兒配方食品》，嬰幼兒配方乳粉中膽堿含量應在1.7～12.0 mg/100 kJ范圍內(nèi)。所抽取的88批次產(chǎn)品，膽堿含量最低為2.68 mg/100 kJ，最高為11.6 mg/100 kJ，均在國家標準規(guī)定的范圍內(nèi)。

表2 市售嬰幼兒配方乳粉膽堿含量統(tǒng)計表

3.3 實驗注意事項

實驗應當注意以下幾點：①乳粉樣品應充分渦旋溶解，并且在水解過程時時搖動，避免結塊。②實驗過程中尤其要注意水解溫度，溫度過低樣品水解不充分，溫度太高又會導致膽堿損失，因此要嚴格控制水解溫度。③膽堿氧化酶受熱受潮極易變質(zhì)結塊，取樣時應處于干燥陰涼的環(huán)境中，用后應立即置于-20 ℃冰箱中并密封保存。④調(diào)節(jié)pH值先采用高濃度的氫氧化鈉溶液（500 g/L）粗調(diào)，當pH值接近3.5時再以低濃度的氫氧化鈉溶液（40 g/L）微調(diào)，避免pH超出范圍。⑤發(fā)色劑應現(xiàn)用現(xiàn)配，若顏色變粉紅則不能使用[4]。

4 結論

膽堿在生物體之中具有不可代替的基本功能，能促進脂肪的分解，傳遞神經(jīng)信號，無論對于嬰幼兒還是成人都有十分重要的作用。人體本身就具有合成膽堿的功能，但是人也需要從膳食中獲取膽堿。越來越多的乳粉生產(chǎn)企業(yè)將膽堿作為營養(yǎng)強化劑添加進乳粉中，因此對膽堿的檢測分析就成為了必要工作。酶比色法測膽堿操作比較簡便、線性良好、檢出限低、精密度高，用此方法檢測市面上88批次乳粉，沒有發(fā)現(xiàn)不合格，表明企業(yè)在此方面質(zhì)量控制良好。